C2.2 二倍浓度革兰氏阴性增菌液(二倍浓度GN增菌液)

　　C2.2.1 成分

　　除蒸馏水改为500mL外，其它成分同附录C2.1.1。

　　C2.2.2 制法

　　制法同附录C2.1.2。

　　C2.3 SS培养基

　　同附录B2.3。

　　C2.4 伊红美蓝琼脂培养基(EMB培养基)

　　同附录A2.3。

　　C2.5　三糖铁琼脂(TSI培养基)

　　同附录B2.5。

　　C2.6　志贺氏菌诊断血清

　　C3　检验程序

　　检验程序见图C。

　　C4　操作步骤

　　C4.1 样品处理和增菌培养

　　C4.1.1 污水

　　取200mL污水，用灭菌滤膜进行抽滤。用100mL二倍浓度GN增菌液把滤膜上截留的杂质洗脱到已灭菌的三角烧瓶内，摇匀，置于37℃恒温培养箱，增菌培养6～8h。

　　注：若样品为经过氯消毒的污水，应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。

　　C4.1.2 污泥

　　取污泥30g，放入灭菌容器内，加入300mL灭菌水，充分混匀制成1：10混悬液。吸取上述1：10混悬液100mL，加入到装有100mL二倍浓度GN增菌液的已灭菌的三角烧瓶内，搅匀，置于37℃恒温培养箱中，增菌培养6～8h。

　　注：若样品为经过氯消毒的污泥，应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。

　　C4.2 分离

　　取上述增菌培养液，分别接种SS培养基平板和EMB培养基平板，置于37℃培养箱中培养24h。

　　挑取在SS培养基平板和EMB培养基平板上呈无色透明，直径1～1.5mL的可疑肠道病原菌菌落。每个平板最少挑取5个菌落，接种于TSI培养基，置于37℃培养箱中培养18～24h。

　　挑取在TSI中，葡萄糖产酸不产气，无动力，不产生硫化氢，上层斜面乳糖不分解的菌株，可做血清学和生化试验。

　　C4.3 鉴定

　　C4.3.1 血清学试验

　　志贺氏菌属分为四个群，先与多价血清作玻璃片凝集试验，如为阳性，再分别与A、B、C、D群血清凝集，并进一步与分型血清做玻璃片凝集，最后确定其血清型。

　　C4.3.2 生化试验

　　应进行葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、蔗糖、靛基质、硫化氢、动力、尿素试验。志贺氏菌属能分解葡萄糖，但不产气(福氏志贺氏菌6型有时产生少量气体)，一般不能分解乳糖和蔗糖，宋内氏志贺氏菌对乳糖和蔗糖迟缓发酵产酸。志贺氏菌属均不产生硫化氢，不分解尿素，无动力。对甘露醇、麦芽糖的发酵及靛基质的产生，则因菌株不同而异。

　　如遇多价血清玻璃片凝集试验为阴性，而生化反应符合上述情况时，可加做肌醇、水杨酸、V-P、橼酸盐、氰化钾等试验。志贺氏菌属均为阴性反应。

　　C5　检验结果报告

　　根据检验结果，报告一定体积的样品中存在或不存在志贺氏菌。

　　附录　D

　　(标准的附录)

　　医疗机构污泥中蛔虫卵的检验方法

　　D1　仪器和设备

　　D1.1　离心机。

　　D1.2　金属筛：60目。

　　D1.3　显微镜。

　　D1.4　恒温培养箱。

　　D1.5　高压蒸汽灭菌器。

　　D1.6　冰箱。

　　D1.7　振荡器。

　　D2　培养基和试剂

　　D2.1　3%福尔马林溶液或3%盐酸溶液

　　D2.2　饱和硝酸钠溶液(比重1.38～1.40)或饱和氯化钠溶液

　　D2.3　30%次氯酸钠溶液

　　D3　检验程序

　　蛔虫卵检验程序见图D。

　　D4　操作步骤

　　D4.1 采样及样品处理

　　样品采集后应立即送到实验室检验。若不能立即检验时，可在100g污泥中加入5mL3%福尔马林或3%盐酸溶液，在4～10℃冰箱内保存。若样品为经过氯消毒的污泥，应在现场取样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。

　　D4.2 蛔虫卵收集

　　D4.2.1 分离

　　将100g污泥样品和50mL5%氢氧化钠溶液，分别注入三角烧杯内，置于振荡器上，以200～300次/min速度振荡30min，然后静置30min，以使蛔虫卵不再粘附在污泥上。

　　D4.2.2 水洗

　　将上述样品分装在离心管内，以2000～2500转/min的转速离心5min。倒去离心管上部的液体，加入容量为沉淀物10倍的蒸馏水，混匀，以2000～2500转/min的转速离心5min，如此反复数次，直至沉淀物上面的液体接近透明。

　　D4.2.3 漂浮

　　离心管内注入饱和硝酸钠溶液或饱和氯化钠溶液，搅匀，以2000～2500转/min的转速离心5min。

　　注1：由于蛔虫卵的相对密度小于饱和硝酸钠溶液和饱和氯化钠溶液的相对密度，管内绝大多数的蛔虫卵会浮聚在液面上。

　　注2：氯化钠溶液投加量以大于沉淀物量20倍为宜。

　　注3：根据污泥性状，可以调整离心转速或时间。

　　D4.2.4 沉淀

　　反复吸取管中浮膜转移至另一离心管中，加入10倍水量的蒸馏水，搅匀，以5000转/min的转速离心5min，慢慢吸去上清液。

　　注：由于蛔虫卵比水的相对密度大，蛔虫卵将沉在管底内。

　　D4.3 培养

　　在离心管中，加入2～3mL无菌的生理盐水或自来水和几滴3%福尔马林溶液，摇匀，转移至试管或直接置于24～26℃恒温箱，培养20天。培养中，若溶液量少于2mL时，应及时补充生理盐水或自来水。

　　D4.4 镜检

　　培养后，将样品静置30mL后吸去试管内上层较浑浊的液体，加入约为沉淀物两倍量的蒸馏水或30%次氯酸钠溶液，混匀，在显微镜下计数死活蛔虫卵数。

　　注1：活虫卵经过20天的培养会逐渐发育到幼虫期，而死虫卵则在同一条件下仍然保持单细胞期或停留于某一发育阶段，故可以区别。

　　注2：30%次氯酸钠溶液能使虫卵最外层蛋白质壳逐渐溶解，便于在显微镜下清晰观察卵内的幼虫。

　　D5　蛔虫卵死亡率计算

　　按下式计算蛔虫卵死亡率：

　　公式中：A--蛔虫卵死亡率(%);

　　m--死亡蛔虫卵数;

　　n--存活蛔虫卵数

　　D6　检验结果报告

　　根据检验结果，报告100g污泥中蛔虫卵死亡率。

　　附录　E

　　(规范性附录)

　　医疗机构污水和污泥中结核杆菌的检验方法

　　E1　仪器和设备

　　E1.1 电炉。

　　E1.2 恒温水浴箱。

　　E1.3 高压蒸汽灭菌器。

　　E1.4 滤菌器。

　　E1.5 离心机。

　　E1.6 恒温培养箱。

　　E1.7 乙酸纤维膜：孔径为0.3～0.7μm

　　E1.8 玻璃漏斗G2：孔径为10～15μm

　　E1.9 玻璃漏斗G4：孔径为3～4μm

　　E1.10 酒精灯

　　E2　培养基和试剂：

　　E2.1 改良罗氏培养基

　　E2.1.1 成分

　　磷酸二氢钾　　　　　　　　　　2.4g

　　硫酸镁　　　　　　　　　　　　0.24g

　　枸橼酸镁　　　　　　　　　　　0.6g

　　谷氨酸钠　　　　　　　　　　　1.2g

　　甘油　　　　　　　　　　　　　12mL

　　淀粉　　　　　　　　　　　　　30g

　　蒸馏水　　　　　　　　　　　　600mL

　　鸡蛋液(包括蛋清和蛋黄)　　　1000mL

　　20%孔雀绿　　　　　　　　　　 20mL

　　E2.1.2 制法

　　将磷酸二氢钾、硫酸镁、枸橼酸钠、谷氨酸钠、甘油及蒸馏水混合于烧杯内，放在沸水浴中加热溶解。加入淀粉继续加热1h，摇动使其溶解，待冷却至50℃加鸡蛋液及孔雀绿，溶解，混匀。制成斜面，保持温度90℃，灭菌1h。

　　E2.2　小川氏培养基

　　E2.2.1　成分

　　甲液：无水磷酸二氢钾　　　　 1g

　　味精　　　　　　　　　 1g

　　蒸馏水　　　　　　　　 100mL

　　乙液：全蛋液　　　　　　　　 200mL

　　甘油　　　　　　　　　 6mL

　　2%孔雀绿　　　　　　　 6mL

　　E2.2.2 制法

　　甲、乙两液混合分装试管内。制成斜面，保持温度90℃灭菌1 h。

　　E2.3 pH为7.0的磷酸盐缓冲液(M/15)

　　E2.4 10%吐温(Tween)80水溶液加等量30%过氧化氢溶液。

　　E2.5 4%硫酸溶液

　　E3　检验程序

　　结核杆菌检验程序见图E。

　　E4　操作步骤

　　E4.1 集菌

　　污水集菌可采用过滤离心法或直接离心法,污泥集菌可采用过滤离心法。

　　E4.1.1 污水样品

　　过滤离心法：用经煮沸消毒的乙酸纤维滤膜(孔径0.3～0.7μm)抽滤，安装严密后，取污水样500mL抽滤，根据悬浮物的多少，一份水样需更换数张滤膜，将同-份水样滤膜集中于小烧杯内。根据滤膜的多少用100～200mL4%硫酸溶液反复冲洗，静置30min后，收集洗液于离心管中，3000转/min，离心30min，弃去上清液，沉淀物中加1mL灭菌生理盐水混合均匀后，供接种用。

　　直接离心法：水样500mL，分装于50mL或200mL灭菌离心管中，3000转/min，离心30min。同一份水样的沉淀物集中于试管内，加等量4%硫酸处理30min，供接种用。如体积过大，再次离心浓缩后接种。

　　注：若样品为经过氯消毒的污水，应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。

　　E4.1.2　污泥样品

　　过滤离心法：取污泥10g加100mL蒸馏水冲洗过滤(滤纸漏斗)，再经玻璃漏斗G2(孔径10～15μm)和G4(孔径3～4μm)抽滤，最后经滤膜(孔径0.45～0.7μm)抽滤。取下滤膜，用4%硫酸3mL，充分振摇冲洗30min。

　　注：若样品为经过氯消毒的污泥，应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。

　　E4.2 接种

　　污水的集菌液：全部接种于改良罗氏培养基或小川氏培养基培养管内斜面上，每支培养管接种0.1mL。

　　污泥的集菌液：吸取两个0.1mL，分别接种于改良罗氏培养基或小川氏培养基培养管内斜面上。

　　E4.3 培养

　　已接种的培养基置于37℃培养箱内培养。培养2周后开始观察结果，每周观察2次。一般需要培养8周。