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前言
中成药、化学药品、生化药品的非灭菌制剂及药用原料、辅料，除另有规定外，皆按本法进行检验。并按中华人民共和国卫生部颁布的《药品卫生标准》及有关规定判定检验结果。注①1984年10月31日卫生部发布的《药品卫生检验方法》同时废止。
药品卫生检验方法总则
1.抽样
1.1 供试品一般按批号抽样
1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应抽选有疑问的样品，但因机械损伤明显破裂的包装不得作为样品。
1.3 凡已能从药品、瓶口(外盖内侧及瓶口周围)外观看出长螨、发霉、虫蛀以及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。
1.4 抽样量一般应为检验用量(2个以上最小包装单位)的3倍量。
1.5 一般采用随机抽样方法抽样。
2.供试品保存
2.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处(勿冷藏或冷冻)，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。
2.2 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得为供试品。
3.检验
3.1 供试品检验项目按中华人民共和国卫生部颁布的《药品卫生标准》确定。
3.2 检验的全过程必须符合无菌技术要求。
3.3 除另有规定外，供试品制备成供试液后，应在均匀状态取样。
3.4 供试品制成供试液后，应在1小时内注皿操作完毕。
4.检验量
4.1 所有剂型的检验均需取自2个以上包装单位。
4.2 口服固体制剂中成药丸剂、片剂、冲剂、散剂、胶剂、茶剂、曲剂、胶囊剂等检验量均为10g。蜜丸除应取自2个以上包装外，还应取自4丸以上。
化学药品、生化药品的粉剂、胶囊剂、片剂、冲剂、滴丸剂等检验量为10g。
4.3 口服液体制剂：糖浆剂、乳剂、合剂、溶液剂、混悬剂、酒剂等检验量为10ml。
4.4 半固体制剂：膏剂等检验量为10g。
4.5 外用液体制剂：滴眼剂、滴鼻剂及其他液体制剂检验量为10ml。
4.6 外用栓剂、软膏剂、眼膏剂等检验量为5g。
4.7 膜剂，除另有规定外，中药膜剂检验量取30～50平方厘米，化学药及生化药膜剂取10平方厘米，以上均需取自2个以上包装并4片以上。
4.8 特殊贵重的或极微量包装的药品，其检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不得低于3g；液体制剂采用原液者不得少于6ml、采用供试液者不得少于3ml；外用药品不得少于5g。
4.9 检查活螨的取样量，见活螨检验法。
5.供试液的制备
5.1 一般供试品的供试液制备方法。
5.1.1 固体供试品 称取10g，置研钵中，以100ml稀释剂(生理盐水或磷酸盐缓冲液(0.1mol／L)分次加入研磨细匀，并转移至250ml锥形瓶中，使成1∶10供试液。或将供试品和稀释剂同置匀浆仪中，以转速3000～5000转／分，开机1一2分钟。
对吸水膨胀或粘度大的供试品，可制成1∶20供试液。
5.1.2 液体供试品 量取10ml，加入含90ml稀释剂的250ml锥形瓶中，混匀成1∶10供试液。
合剂(含王浆、蜂蜜者)、滴眼剂等可以原液为供试液。
5.1.3 半固体供试品 称取10g，加入含100ml稀释剂的250ml锥形瓶中，混匀成1∶10供试液。
5.2 特殊供试品的供试液制备方法
5.2.1 非水溶性基质供试品供试液的制备方法
(1)软膏剂、乳膏剂吐温西黄蓍胶(或羧甲基纤维素钠)法 称取供试品5g，置研钵或烧杯中，加吐温一80①8ml，充分研匀。加入西黄蓍胶或羧甲基纤维素钠②2.5g，充分研匀以92ml45℃的稀释剂，边加边研磨，使成均匀乳剂，并移至250ml锥形瓶中，即为1∶20供试液。注① 吐温一80预先以121℃高压灭菌20分钟。 ② 西黄蓍胶、羧甲基纤维素钠预先以140℃干热灭菌30分钟。至原注液体石蜡吐温法 称取供试品5g，分别量取液体石蜡(液体石蜡，预先以160℃干热灭菌2小时)20ml，吐温一80 20ml，稀释剂60ml。先将供试品置研钵中，边研磨边加液体石蜡，然后再边研磨边滴加吐温一80，研磨均匀后，再边加稀释剂边研磨，初始每次约1ml，待起团块时，加入量可增至约3ml，稍停1分钟，再轻轻研磨至乳化，将稀释剂加完为止。即得1∶20供试液。
(2)栓剂 称取供试品5g，置250ml锥形瓶(内含玻璃珠若干粒)中，加适量稀释剂，置45℃水浴浸泡10分钟使融，加吐温一802～4ml，振摇使之乳化，再加稀释剂(稀释剂和吐温总量为50ml)制成1∶10供试液。
(3)油剂 量取供试品10ml，加入1％吐温一80稀释剂90ml，混匀，制成1∶10供试液。
5.2.2 胶囊剂、胶丸及胶剂供试液制备方法
(1)胶囊剂、胶丸剂 称取供试品10g置锥形瓶中，加入稀释剂100ml，于45℃水浴中振摇至溶，即为1∶10供试液。
(2)胶剂 取胶剂若干，捣碎，称取10g，再用研钵研细，转入250ml锥形瓶中，加入稀释剂100ml，置于45℃水浴中，振摇使溶，即为1∶10供试液。
5.2.3肠溶胶囊(片)剂供试液制备方法称取供试品10g，置锥形瓶中并放入45℃水浴，加入PH6.8磷酸盐缓冲液(附录二2)100ml，保温、振摇，使肠衣溶解，混匀，即得1∶10供试液。
5.2.4 气雾剂供试液制备方法。
将供试品置冰室内2小时后，取出，用灭菌钢锥小心钻孔，使抛射剂缓慢释放，然后再用灭菌注射器加入适量稀释剂，混匀后吸取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1∶10供试液。
5.2.5 膜剂供试液制备方法
中药膜剂 除另有规定外，取30一50平方厘米，将药膜剪成碎片，置锥形瓶中，加稀释剂适量，使每10ml含1平方厘米浓度，浸泡10～15分钟，摇匀，即得。
化学药膜剂 除另有规定外，取10平方厘米，置锥形瓶中，加稀释剂100ml，浸泡、振荡使溶，即得。必要时，可置45℃水浴中助溶。
5.3 含抑菌成分供试品的供试液制备方法。
凡含有防腐剂或抑菌成分且影响检验(阳性对照控制菌不生长)的供试品，可根据供试品的性质，控制菌的特性及检验条件等按下列方法之一(或两种以上方法联合应用)及其他适宜方法处理后，作控制菌检验。
5.3.1 离心沉淀法可溶性供试液 取供试液10ml，置入刻度离心管中，以3000转／分以上离心沉淀30分钟，用毛细吸管吸取上清液弃掉，留下管底约2ml残余液，将其全部洗入增菌培养基中，作控制菌检验。
混悬供试液 取供试液10ml，置刻度离心管中，先以500转／分离心沉淀5分钟，取其上层液移入另一离心管中，再经3000转／分以上离心沉淀30分钟，弃去上清液，保留约2ml残余液，全部洗入增菌培养基中，作控制菌检验。
本法适用于一些抑菌作用不强的中、西药品，如蜜丸、水丸、片剂、散剂、冲剂、胶囊剂及液体制剂。
应用本法须严防操作污染，并注意上层液或上清液和管底残渣的分离，避免沉渣混入其中。
5.3.2 薄膜过滤法
取规定量的供试液，按1ml加生理盐水约10ml的比例，混匀，置入薄膜过滤器内，减压过滤至干，再以生理盐水或其他适宜溶剂冲洗滤膜3次，每次50ml。取出滤膜，剪成2一4片，使每片相当于供试品1g或1ml。放入增菌培养基中，作控制菌检验。
本法适用于水溶性抑菌成分的中、西药品和滴眼剂等的制剂“灭活”处理。
安放滤膜时，注意滤膜与滤器应密合，防止滤膜破损、漏液。本法所用微孔滤膜孔径应为0.45±0.02μm。
5.3.3 钝化剂中和法磺胺类药物中和法 取规定量供试液，加入含1％对氨基苯甲酸0.5ml的100ml增菌液中，作增菌培养即得。
本法适用于含磺胺较少的制剂、如三磺软膏、消炎眼药水、斑马眼药水等。
应用本法可因供试品不同，对氨基苯甲酸的用量，可适当调整。
含重金属药物中和法 取规定量供试液，加入硫乙醇酸钠一胱氨酸增菌液(附录三36)100ml中，作增菌培养即得。
本法适用于含重金属盐类药物的检验，如磺胺嘧啶银软膏等。
含洗必泰等制剂中和法 取规定量供试液，加入含适量吐温一80等表面活性剂的增菌液中，作增菌培养即得。
本法适用于洗必泰含片、洗必泰栓、霉滴栓及其他含抑菌成分的供试品。
应用本法须注意，由于供试品不同，用量应预试，表面活性剂的用量应预试，用量不可过大，否则本身亦产生抑菌作用。
5.3.4 沉降法
(1)取规定量供试液，自然沉降5分钟，吸取上层液于增菌液中，作增菌培养即得。
(2)取规定量供试液，自然沉降5分钟，吸取上层液于含1％对氨基苯甲酸1ml的增菌液中，作增菌培养即得。
本法适用于水溶性小的抗菌制剂检验，如磺胺类药。(1)法适用于单一成分固体制剂，如磺胺嘧啶片检验；(2)法适用于复方磺胺制剂，如复方磺胺嘧啶片、复方新诺明片等检验。
应用本法时，供试品应充分研细，并与稀释剂充分摇匀，使污染菌分散于液相中；沉降时间不宜超过5分钟，以防菌细胞下沉；取上层液时，避免吸入药渣。
5.3.5 稀释法取供试液10ml，加入较大量增菌液中(使该供试品稀释至阳性对照菌能生长的浓度)，作增菌培养即得。
本法适用于抑菌作用不强的中药、化学药品检验。
6.对照试验
6.1阴性对照试验 测试检验全过程无菌技术的可靠性。
6.1.1 菌数测定阴性对照试验：用吸管从供用的稀释剂中各吸取1ml于4个无菌平皿中，分别按细菌数、霉菌数测定方法注皿培养、检查，不得长菌。
6.1.2 控制菌检验阴性对照试验：用吸管从供用的稀释剂中吸取1ml于增菌液中，按控制菌检验方法检查，不得长菌。
6.2 阳性对照试验 检查供试品是否对控制菌生长产生干扰作用及检查培养条件是否适宜。
6.2.1 阳性对照试验 方法同供试品检验，于供试液中加入一定量的相应对照菌，作平行试验。
6.2.2 规定阳性对照菌株：大肠杆菌(CMCC(B)44102)、沙门氏菌(CMCC(B)50094、绿脓杆菌(CMCC(B)10104)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)及破伤风杆菌(CMCC(B)64067)。
6.2.3 对照菌的加入量为50～100个，可事前预试确定。
需气菌常用计数方法，取37℃培养18～20小时的新鲜肉汤培养物，10倍递增稀释至0.000006，取其0.1ml于普通肉汤琼脂平板表面涂抹或取0.0000007稀释液1ml以注皿法进行菌数测定。
6.2.4 当供试品未检出供试菌时，而阳性对照试验也未能检出，不能做出供试品未检出控制菌的结论。
6.2.5 阳性对照试验操作必须与供试品检验操作严格分开，避免交叉污染。
7.检验报告单位
7.1 细菌数、霉菌数和酵母菌数的测定一般以1g或1ml为单位的菌落数表示。中药膜剂以10平方厘米、化学药及生化药膜剂以1平方厘米为单位的菌落数表示。眼科用药的霉菌和酵母菌数以1g或1ml为单位的菌落数或“未检出”表示。
7.2 控制菌检验报告 一般以1g或1ml、中药膜剂以10平方厘米、化学及生化药膜剂以1平方厘米为单位报告“检出”或“未检出”。
8.复试
8.1 菌数测定不合格者应复试。控制菌检验以1次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株1个月备查。
8.2 复试项目以不合格项目为准，作单项复试。
8.3 复试需另取同批号样品，测定2次。
8.4 复试报告 以3次测定结果的算术平均值报告。
8.5 眼科用药的霉菌和酵母菌数复试报告，须以二次复试结果均不得长菌，方可判定合格。
9.特别抽样不符合部颁药品卫生标准规定的药品，经卫生行政部门审批准予在不影响外观与质量的前提下，充许采取适宜措施进行处理，处理后的药品抽样按本款进行。
9.1抽样方法大包装抽样，按出厂的大包装，10件以下抽1件，10件以上每增加20件加抽1件，最后不足10件者不加抽，超过10件加抽1件。小包装抽样，按规定手续，从大包装中随机抽取小包装2个以上单位为供试品。
9.2检验项目：按部颁《药品卫生标准》规定检验，不得单项检验。
9.3检验报告
9.3.1测定菌数报告：以各次测定结果全部平均值报告。
9.3.2控制菌按全部复试检验结果报告①，如全部复试均未检出控制菌时，报告为：“按规定抽样检验结果未检出××菌”；①如全部抽样中任一样品检出控制菌时，报告为：“按规定抽样检验，检出××菌，不符合药品卫生标准规定”。注① 报告中写出具体的控制菌名称。
细菌数测定
细菌数是指规定单位的非规定灭菌药品制剂中污染活细菌的数量。是判定药品受到细菌污染程度的标志。其内含是多义的。细菌数愈多，表明药品受到致病微生物污染的可能性以及药品制剂的变质可能性也愈大，安全性也就越差。同时细菌数测定也是对生产单位的药品原辅料、器具设备、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。
细菌数测定采用平板菌落计数法，是一种活菌计数法。测定结果只反映出在规定条件下生长的细菌数，不可能包括在本法条件下不生长的细菌，因而测定数只可能低于实际的污染数。此外，测定中1个细菌可能繁殖成1个菌落，而一群也可能只形成1个菌落，以及污染的不均匀性等等原因，极易造成测定差异。故在测定细菌数时，必须严格按本法所规定条件操作。
1.培养基、试剂
1.1 肉汤琼脂(或0.001％TTC肉汤琼脂)(附录三2，4)
1.2 PH7.2磷酸盐缓冲液(0.1mol／L)或生理盐水
(附录二)
2.检验程序
↓1ml ↓1ml ↓1ml
↓ 干燥
30～35℃↓48±2小时
↓
3.操作步骤
3.1 供试液制备，经阴性对照取样后，按各类制剂制备供试液的方法(总则5)制备。
3.2 稀释及吸样稀释级一般应采用3级。
稀释 取1ml吸管1支，吸取混匀的1∶10供试液(或原液、1∶20供试液)1ml，在离稀释剂液面上约1cm处，沿管壁注入装有9ml的稀释剂的试管中，混匀成1∶100(或1∶10、1∶200)的稀释液。
吸样 用上述吸管分别取1∶10供试液(或原液、1∶20供试液)1ml，注入2～3个平皿中。
以另一支1ml吸管，按上述操作，作下一级的稀释与吸样。
操作时，应特别注意每次吸液前必须使稀释液充分混匀(吸管反复吹吸数次或充分震荡)，以使菌体充分均匀分散，降低测定误差。
3.3 倾注琼脂(注皿)与干燥
3.3.1 事先将肉汤琼脂融化、置45℃水浴中，备用
3.3.2 当供试液及各级稀释液均注入平皿后，以上述琼脂倾注入平皿，每皿约15ml，随即转动平皿，使样液与琼脂混匀后置水平台上待凝。
3.3.3 干燥 琼脂凝固后，在净化条件下开盖倒置或换灭菌的陶瓦盖，使平板干燥，减少平板表面的水分，防止菌落蔓延生长。干燥时间一般在3小时左右，干燥时间计入培养时限。
3.4 将上述平板倒置于30～35℃培养箱中，培养48±2小时。
4.菌落计数
4.1 细菌菌落是1个菌细胞或菌细胞团在局限位置上，经一定条件繁殖成肉眼可见的细菌群体。由于细菌种类繁多，形成菌落大小、形状、色泽、透明度等皆因种而异，差别甚大。计数时一般用透射光于平板背面或正面仔细观察。不要漏计琼脂层内和平板边缘生长的菌落。并须注意细菌菌落与药渣或培养基的沉淀物，酵母菌及霉菌菌落的区别。必要时，用显微镜鉴别。
4.2 用肉眼直接计数、标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。
4.3 若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。
4.4 平板上有片状菌落或花斑样菌落蔓延生长以及平板受到污染的情况，该平板计数无效。
4.5 计算各稀释级平均平板菌落数。
4.5.1 当用一稀释级使用2个平板时，应采用2个平板菌落数的均值为平均平板菌落数。若2个平板菌落数相差在1倍以上时，该稀释级不宜采用，但不包括2个平板菌落数均在15个以下的情况①。
注① 15以下两平板菌落数允许幅度0～4、1～7、2～9、3～10、4～12、5～14、6～15、7～17、8～18、9～19、10～20。
4.5.2 当同一稀释级使用3个平板时，应采用3个平板菌落数的均值为平均菌落数。若其中1个平板菌落数与其他2个相近的平板菌落数的均值相差1倍以上时，该平板菌落数不能参与平均，但不包括平板菌落数均在10个以下的情况②。
注② 10以下3平板最大与最小菌落数的允许幅度，0～3、1～5、2～7、3～9、4～10、5～12、6～13、7～14。
5.菌数报告规则一般宜选取平均平板菌落数在30～300间的稀释级，作为菌数计算的依据。
5.1 若有1个稀释级的平均平板菌落数处在30～300时，将该稀释级的平均平板菌落数乘以稀释倍数，为报告菌数。
5.2 若有2个稀释级的平均平板菌落数处在30～300时，先计算两稀释级菌落数的比值。
高稀释级的平均平板菌落数×稀释倍数低稀释级的平均平板菌落数×稀释倍数
5.2.1 当比值≤2时，以两级的菌落数均值为报告菌数。
5.2.2 当比值＞2时，以低稀释级平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。
5.3 若有3个稀释级的平均平板菌落数均处在30～300时，采用后2个稀释级计算级间比值。
5.3.1 当比值≤2时，以两级的菌落数的均值为报告菌数。
5.3.2 当比值＞2时，以低稀释级平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。
5.4 若各稀释级平均平板菌落数均在300以上，按最高的稀释级的平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数，或适当增加稀释级，重作测定后报告结果。
5.5 若各稀释级的平均平板菌落数均不在30～300间，其中一稀释级的平均平板菌落数大于300，相邻稀释级的平均平板菌落数又小于30时，以最接近30或300的稀释级平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。
5.6 若各稀释级平均平板菌落数均小于30时，按最低稀释级的平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。但若应用原液为供试液，当1∶10稀释级与原液的平均平板菌落数相等或大于时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。
培养基稀释法：
吸取供试液(原液或1∶10供试液)1ml，注入5个平皿内(每皿0.2ml，总量为1ml)。共作3份，共15个平皿。每皿倾注融化并冷至45℃左右的普通肉汤琼脂约15ml，旋转混合，冷凝后按规定培养温度与时限培养、计数。
将每ml注入5个平板的菌落计数结果合并为每ml菌落数，共得3组数据。取3组数据平均值乘稀释倍数，为报告菌数。
5.7 若各稀释级的平均平板菌落数均无菌落生长或测定数在10个以下时，报告菌数为＜10个。
表1 细菌数报告规则举例
6.报告数书写
6.1 菌落数在100个以内时，按实测数书写报告。
6.2 菌落数大于100时，取二位有效数字，第三位数按有效数字处理规则处理，为简便计，也可用10的指数报告。
霉菌和酵母菌数测定
霉菌和酵母菌数是指规定单位非规定灭菌药品制剂中污染的霉菌和酵母菌的活菌数量。
霉菌和酵母菌广泛分布于自然界，土壤、空气及水中都有它们的菌体及孢子存在。因而在药品生产、贮藏等各个环节均可污染药品，以致引起药品变质，危害人体健康。有些霉菌毒素也是重要的致癌物质。
霉菌和酵母菌数是判定药品受到污染程度的标志之一，也是对药品原料、生产工艺、生产环境以及操作人员卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。
霉菌和酵母菌种属繁多，采用一种培养基和培养条件，不可能适合所有霉菌和酵母菌的生长繁殖。故本法测定结果只能是在一定条件下平板生长的霉菌和酵母菌菌落数。本法规定，一般制剂用虎红琼脂作霉菌数测定(液体制剂包括酵母菌数)。但含蜂蜜或王浆的合剂另以酵母膏，蛋白胨、葡萄糖(YPD)琼脂作酵母菌数测定，而霉菌数测定仍用虎红琼脂。
1.培养基、试剂
1.1 PH7.2磷酸盐缓冲液(0.1mol／L)(附录二2)
1.2 生理盐水(附录二2)
1.3 YPD琼脂培养基(附录三6)
1.4 虎红琼脂培养基(附录三5)
2.检验程序
↓ 滴眼剂 ↓ ↓
↓
↓
↓
25～28℃↓72±2小时
↓
3.操作步骤
3.1 供试液的制备(总则5)与稀释，按细菌数测定项下的方法进行。稀释级一般采用3级。合剂(含蜂蜜或王浆者)和滴眼剂可用原液作第1级供试液，分别在作10倍递增稀释的同时，即可取该稀释级的吸管吸取1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释级2～3个平皿。
3.2 各稀释液注入平皿后，应及时将融化并冷至45℃左右的虎红琼脂培养基(如供试品为含蜂蜜或王浆的合剂，加用YPD琼脂培养基测定酵母菌数)约15ml倾注平皿内，摇匀待凝。
3.3 凝固后，置25～28℃培养箱内，一般培养72±2小时，如有可疑，可标记后适当延长培养时间。
4.菌落计数方法
4.1 菌落形态
4.1.1 霉菌菌落形态：具有放射状或树状分枝的菌丝是霉菌菌落的特征。初形成时，多无色透明，有明显的折光性，在较暗的背景下，以透射光观察，易于识别。少数生长在琼脂表面的菌落，初起时，似为1小块水迹，需借助暗反射光才能看清。成熟的霉菌菌落多数有各种颜色的孢子形成，随种而异，极易判定。
4.1.2 酵母菌菌落形态：在虎红琼脂平板上，多数为圆形凸起，边缘整齐，表面光滑湿润，呈不透明乳脂状，乳白色或粉红色。少数表面粗糙或皱褶，有的菌落周边呈细分枝状。位于琼脂内的菌落，可呈铁饼形、三角形及多角形。菌落外观与细菌菌落不易区别时，应挑取菌落，用水制片，置高倍显微镜下观察，其细胞个体比细菌大数倍，多为圆形或卵圆形，绝大多数为出芽繁殖。当平板内酵母菌菌落甚多时，常有酒香气。
在YPD琼脂平板上的菌落与虎红平板上的形态相似，但稍大，多数为乳白色。
4.2 菌落计数：一般在平板背面用肉眼直接点数，必要时用放大镜检查，以防遗漏。若有根霉或毛霉蔓延生长时，为避免影响其它霉菌和酵母菌计数，应及时将平板取出计数或从平板背面观察霉菌生长中心点或霉菌蔓延生长区域来计数。固体制剂仅计数霉菌菌落；液体制剂应计数霉菌菌落和酵母菌菌落的总数；含王浆或蜂蜜的合剂则应将虎红平板上的霉菌数加上YPD平板上的酵母菌数为霉菌和酵母菌总数，计算各稀释级的平均平板菌落数。
5.菌数报告规则
5.1 选择菌落数在30～100之间的稀释级平板计数，以该稀释级的平均平板菌落数乘稀释倍数作为报告菌数。
5.2 若邻近的2个稀释级平均平板菌落数均在30～100之间，计算级间比值。当比值≤2时，以两级菌落数的平均值为报告菌数；比值＞2时，按低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为报告菌数。
5.3 各稀释级平均菌落数均不足30时，以最低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为报告菌数。
6.菌数报告的书写
6.1 固体制剂报告霉菌数；液体制剂及半固体制剂报告霉菌和酵母菌的总数。
6.2 菌数报告的书写参照细菌数测定。
6.3 眼科用药各稀释级(含原液)均未生长菌落时，报告“未检出”。
大肠杆菌检验法
大肠杆菌为肠杆菌科埃希氏菌属细菌，是人和温血动物肠道内的常住菌，随粪便排出体外，可直接或间接污染药品及药品生产的各个环节。药品中检出大肠杆菌表明该样品已受到粪便污染，服用后有可能被粪便中存在的肠道致病菌或寄生虫卵等病原体感染。因此，大肠杆菌被列为粪便污染指示菌，是非规定灭菌口服药品的常规必检项目。
1.培养基、试剂
1.1 普通肉汤培养基(附录三1)
1.2 胆盐乳糖(BL)增菌液(附录三7)
1.3 乳糖发酵管(附录三13)或5％乳糖发酵管(附录三14)
1.4 蛋白胨水培养基(附录三10)
1.5 磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基(附录三11)
1.6 西蒙氏柠檬酸盐培养基(附录三12)
1.7 伊红美蓝(EMB)琼脂(附录三8)
1.8 麦康凯琼脂(附录三9)
1.9 柯凡克试剂(附录二4)
1.10 甲基红指示剂(附录二4)
1.12 革兰氏染色液(附录二1)
2.检验程序
↓
↓
36±1℃↓18～24小时
36±1℃↓18～24小时
疑似菌落生长 无菌落生长
↓ ↓
±1℃ ↓ 18～24小时
↓ ↓ ↓
↓
3.操作步骤
3.1 增菌培养 取供试液(总则5)10ml，加入备妥的100mlBL增菌液内，置36±1℃培养18～24小时。增菌液呈现混浊。液面可见或未见气泡都表明有菌生长，如未见明显混浊，可延长增菌培养时间至48小时。
3.2 分离培养 将上述增菌培养液轻微摇动，以接种环沾取1～2环划线接种于EMB或麦康凯琼脂平板上。置36±1℃培养18～24小时(必要时延长培养时间)，观察菌落生长情况，大肠杆菌在EMB琼脂平板上的典型菌落呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂平板上的典型菌落呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。由于药物影响或非典型菌的存在，大肠杆菌可出现非典型形态；在EMB琼脂平板上呈现浅紫、粉紫、粉色，无明显暗色中心；在麦康凯琼脂平板上呈现微红色或粉色，菌落形态、质地也有改变。以上形态均应作为疑似菌落进行鉴定，切勿遗漏。
分离平板上无菌落或无疑似菌落生长，可作出未检出报告。
以接种针轻轻接触单个疑似菌落的中心，沾取培养物，每次应挑取2个或更多个疑似菌落，接种于普通肉汤琼脂斜面或三糖铁琼脂斜面上。置36±1℃培养18～24小时，供革兰氏染色镜检及生化试验用。
在上述检验过程中若发现疑似的其它规定控制菌时，亦应继续鉴定。
3.3 革兰氏染色镜检 将上述普通肉汤琼脂斜面培养物涂片，作革兰氏染色镜检。大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢短杆菌。由于菌龄等原因，菌体长短可有变化。
3.4 生化反应
3.4.1 将上述斜面培养物接种于乳糖发酵管，置36±1℃培养24～48小时，观察结果。大肠杆菌应发酵乳糖并产酸产气，或产酸不产气。产酸者，以酸性复红为指示剂的培养基显红色；以溴麝香草酚蓝为指示剂的培养基显黄色。产气者，倒管内有气泡。
为避免迟缓发酵乳糖造成假阴性，可选用5％乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌可于24小时内出现阳性反应。
3.4.2 IMViC试验靛基质试验 将斜面培养物接种于蛋白胨水培养基中，置36±1℃培养48±2小时。沿管壁加入柯凡克试剂0.3～0.5ml，轻微摇动，观察液面颜色。阳性反应为玫瑰红色；阴性反应为试剂本色。
甲基红试验 将斜面培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基中，置36±1℃培养48±2小时。于每ml培养液中加入甲基红指示剂1滴，立即观察结果，阳性反应培养液为鲜红色或桔红色；阴性反应呈黄色。
％KOH)0.4ml，充分振摇，观察结果。阳性反应立刻或数分钟后出现红色。加试剂后4小时无红色反应时为阴性，如出现红色亦应判为阳性。
柠檬酸盐利用试验 将斜面培养物接种于西蒙氏柠檬酸盐斜面，置36±1℃培养48±2小时，观察结果。斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性反应；斜面无菌苔生长，培养基颜色无改变为阴性反应。
若斜面有微量菌苔生长或颜色改变等可疑现象时，应将待检菌株重新分离、纯化后，再行试验。
反应的培养物，应将所分离的待检菌株于EMB或麦康凯琼脂平板上重新划线分离后，再作生化试验证实。
表2 大肠杆菌同有关细菌的IMViC鉴别及应用
4.结果报告 完全符合以下结果时，判定为检出大肠杆菌
(1)染色镜检是革兰氏阴性无芽孢杆菌；
(2)乳糖发酵产酸产气，或产酸不产气；
沙门氏菌检验法沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属细菌，广泛分布于自然界，是人畜共患的肠道病原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒，危害人类健康。
沙门氏菌可通过人类、畜、禽的粪便或带菌者直接或间接污染药品，生产环境及生产的各个环节，特别是以动物、脏器为原料的药品污染机率较高。
受到污染的药品，不仅直接影响服用者的安全，并可造成沙门氏菌的传播和流行。故对某些药品必须检查沙门氏菌。
药品中污染的沙门氏菌常在生产过程中受到损伤而处于濒死状态，故检验时须先在无选择性的增菌液中使其复苏，然后再进行选择性增菌。
1.培养基、试剂
1.1 普通肉汤培养基(附录三1)
1.2 四硫磺酸盐增菌液(附录三15)
1.3 胆盐硫乳(DHL)琼脂(附录三17)
1.4 沙门氏菌属志贺氏菌属(S.S)琼脂(附录三18)
1.5 EMB琼脂(附录三8)
1.6 麦康凯琼脂(附录三9)
1.7 三糖铁(TSI)琼脂(附录三16)
1.8 蛋白胨水培养基(附录三10)
1.9 尿素琼脂培养基(附录三19)
1.10 氰化钾培养基(附录三20)
1.11 赖氨酸脱羧酶培养基(附录三21)
1.12 糖发酵培养基(附录三13)
1.13 半固体肉汤琼脂(附录三3)
1.15 革兰氏染色液(附录二1)
1.16 柯凡克试剂(附录二4)
2.检验程序(见下页)
3.操作步骤
3.1 增菌培养 取供试液(总则5)10ml，加入备妥的100ml普通肉汤内，混匀。置36±1℃培养18～24小时。轻微摇动培养液，取1ml加入含10ml四硫磺酸盐增菌液的试管内，再置36±1℃培养24±2小时。如有菌生长，增菌培养液变混。
↓
↓
36±1℃ ↓18～24小时
36±1℃ ↓24±2小时
36±1℃ ↓24±2小时
36±1℃ ↓24±2小时
↓
↓ ↓
↓
3.2 分离培养 轻微摇动增菌培养液，以接种环沾取1～2环接种于DHL(或S.S)琼脂平极及EMB(或麦康凯)琼脂平板各1个。
于36±1℃培养24±2小时，检查平板上有无疑似沙门氏菌落。沙门氏菌在上述平板上典型菌落形态见表3。
表3 沙门氏菌在选择性平板上的菌落特征由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门氏菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意挑选。
3.3 初步筛选试验 以接种针轻轻接触菌落的中心部位，沾取选择性平板的疑似菌落2个或更多个，划线接种于TSI琼脂斜面并穿剌底层。置36±1℃培养24±2小时观察结果。沙门氏菌在TSI琼脂斜面的反应为：斜面呈碱性(红色)，底层呈酸性(黄色)，硫化氢阳性(底层黑色)或阴性(无黑色)。
沙门氏菌及有关细菌在TSI琼脂上的反应见表4。
表4 沙门氏菌及其它细菌在TSI琼脂的反应结果上表中反应序号1，2，3的反应结果，应作为沙门氏菌疑似菌株继续鉴定。其它反应结果可不作为沙门氏菌疑似菌株而加以排除。对有疑问的菌株，可补做乳糖、蔗糖发酵及氧化酶试验，沙门氏菌均应为阴性反应。
取疑似菌株的TSI琼脂斜面或肉汤琼脂斜面36±1℃18～24小时的培养物，涂片作革兰氏染色，镜检。沙门氏菌应为革氏阴性杆菌。
3.5 生化反应 取沙门氏菌疑似菌株的TSI斜面培养物，作以下试验：
3.5.1 靛基质试验 用接种环沾取少量培养物，接种至蛋白胨水培养基中，照大肠杆菌检验方法项下操作、判断结果。沙门氏菌应为阴性反应。
3.5.2 尿素酶试验 用接种环沾取培养物，划线接种于尿素琼脂培养基上。置36±1℃培养24小时，观察结果。如斜面变为红色为阳性反应；阴性反应不变色。沙门氏菌应为阴性反应。
3.5.3 氰化钾试验 取36±1℃培养20～24小时的疑似菌株肉汤培养液，用接种环沾取1环，接种至氰化钾培养基内，另取一环接种于对照培养基内。接种后即以橡胶塞塞紧，置36±1℃培养24～48小时，观察结果，对照管内有菌生长(混浊)，而试验管也有菌生长者为阳性(不受抑制)。经48小时培养后，对照管有菌生长，而试验管无细菌生长时为阴性(受抑制)。沙门氏菌应为阴性反应。
本试验应十分注意密封管口，夏天分装培养基宜在水浴中进行，以防氰化钾分解。产生氢氰酸逸出，致使氰化钾浓度下降，细菌生长，造成假阳性。
3.5.4 赖氨酸脱羧酶试验 用接种环沾取少量培养物，接种在赖氨酸脱羧酶培养基中，同时接种对照培养基。置36±1℃培养24～48小时，观察结果。对照管黄色，试验管呈紫色时为阳性反应(赖氨酸脱羧产碱)；黄色为阴性反应。沙门氏菌应为阳性反应。
表5 沙门氏菌与有关细菌生化反应初步鉴别
注：(1)硫化氢试验以TSI培养基结果为准上述反应序号1，2，3可能为沙门氏菌，其它5种反应结果可以排除沙门氏菌。
反应序号1为沙门氏菌属典型反应。其中若靛基质反应阳性(反应序号2)，应补做甘露醇和山梨醇发酸试验，沙门氏菌皆为阳性反应。若尿素酶、氰化钾及赖氨酸脱羧酶3项试验中有1项异常时，仍应作为沙门氏菌疑似菌株，继续鉴定；若有2项异常，可排除沙门氏菌。
反应序号3者应排除TSI斜面产酸的菌株，结合动力试验阳性。作为沙门氏菌疑似菌株继续鉴定。
3.6 动力检查 用接种针沾取培养物，穿刺接种半固体肉汤琼脂管，置36±1℃培养24小时，观察结果。有动力的细菌能运动到穿刺线外呈四周扩散生长，使培养基呈现混浊蔓延现象；无动力的细菌仅没穿刺线生长，周围培养基清晰。无动力表现的培养物，应在室温保留2～3天后，再观察。沙门氏菌除少数例外，均具有周身鞭毛，能运动。
3.7 血清学试验 在洁净载玻片近中心区的一端，以接种环沾取沙门氏菌属A～F“0”多价血清2～3环，再挑取疑似菌株的TSI斜面上部的培养物少许，与血清混合(要小心操作，以防外溅，污染四周)，将玻片前后侧动，在暗背景下观察结果。如为阳性反应，通常在3分钟内出现凝集现象。有时反应迟缓，需将玻片置培养皿内，并在皿内放湿棉球1个，以防干涸，约过20分钟，再观察结果。
凡与血清出现凝集者，应以生理盐水与同一菌株培养物作对照试验。
对照应无凝集现象方可确定为阳性反应。
当与血清未出现凝集时，应以接种环取上述斜面培养物，置于含少量生理盐水的试管中，制成浓菌悬液，在100℃水浴中保温30分钟，待冷，再以此处理后的菌悬液与沙门氏菌属A～A“0”多价血清作凝集试验。如出现凝集，应判为阳性反应；如不出现凝集，则为阴性反应。
4.结果报告及处理 凡疑似菌株培养物①生化试验及血清学试验结果按表6情况报告结果或提出进一步鉴定意见。
注① 疑似菌培养物系指TSI琼脂斜面反应序号为1，2，3，的培养物。
＊生化反应符合系指生化反应序号1，2(甘露醇及山梨醇均为阳性)及3(乳糖、蔗糖应为阴性，动力应为阳性)的初步鉴别试验结果；不符合系指反应序号4、5、6、7、8的鉴别结果。
绿脓杆菌检验法
绿脓杆菌为假单胞菌属细菌，学名为铜绿色假单胞菌。本菌对人类有致病力，并对许多药物具有天然的耐药性。烧伤、烫伤、眼科疾患和其他外伤，常因绿脓杆菌引起继发感染，是常见的化脓性感染菌，可造成眼角膜溃疡、失明，引起败血症等严重病患。本菌在自然界分布广泛，土壤、空气、水以及人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在。故可通过生产的各个环节污染药品。因此，一般眼科用制剂和外用药品，规定不得检出绿脓杆菌。
1.培养基、试剂
1.1 普通肉汤培养基(附录三1)
1.2 十六烷三甲基溴化铵琼脂(附录三22)
1.3 普通肉汤琼脂斜面(附录三2)
1.4 PDP琼脂斜面(附录23)
1.5 明胶培养基(附录24)
1.6 硝酸盐胨水培养基(附录三25)
1.7 1％盐酸二甲基对苯二胺液(附录二4)
1.8 HCI(1mol／L)(附录二4)
1.9 氯仿
2.检验程序
3.操作步骤
3.1 增菌培养取供试液(总则5)10ml，接种于100ml胆盐乳糖增菌液中(滴眼剂可接种于普通肉汤中)，置36±1℃培养18～24小时。如有绿脓杆菌生长，培养液变混，液面多有1层菌膜，表层常呈黄绿或蓝绿色。
含有抑菌成分的滴眼剂等液体制剂，可取供试品2ml，用薄膜过滤法(总则5.3.2)过滤并冲洗滤膜，将滤膜剪成2片，分置于2瓶100ml胆盐乳糖增菌液或(或普通肉汤)中(与金黄色葡萄球菌同时检验时，取样4ml，过滤后剪成4片，分置于二种增菌液4瓶中)，其中1瓶加入规定量的对照菌作阳性对照。置36±1℃培养18～24小时。
3.2 分离培养 以接种环沾取增菌培养液(如有菌膜，应挑取之)，划线于十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，于36±1℃培养18～24小时。
绿脓杆茵在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上的典型菌落为扁平无定形，边缘不齐，周边呈扩散现象，常互相融合，表面湿润、无光泽、呈灰白色。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色。但亦有不产色素的菌株，菌落亦有粗糙型和侏儒型等。应注意挑选。
分离平板若无菌落生长，可作出“未检出”报告。若生长，以接种针沾取2～3个疑似菌落培养物分别接种至肉汤琼脂斜面上，36±1℃培养18～24小时。
3.3 革兰氏染色镜检 取普通肉汤琼脂斜面培养物，涂片、革兰氏染色，镜检。绿脓杆菌为革兰氏阴性、无芽孢杆菌，菌体长短不一，可呈多形性排列、成双或短链状。本菌体一端有1根鞭毛，以活体观察，可见活泼动力，以鞭毛染色法(附录二、12)可见单端鞭毛。
3.4 生化试验
3.4.1 氧化酶试验 取一小块白色洁净的滤纸片置平皿内，以无菌玻璃棒挑取肉汤琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸片上，随即滴加1滴新配制的1％盐酸二甲基对苯二胺试剂，在30秒钟内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，氧化酶试验为阳性，可作出未检出绿脓杆菌报告。
3.4.2 绿脓菌素试验 取肉汤琼脂斜面培养物，接种在测定绿脓菌色素用的PDP琼脂斜面上，置36±1℃培养24小时后，在试管内加氯仿3～5ml，搅碎并充分振摇，使培养物中的色素提取在氯仿液内。待氯仿提取液呈蓝绿色时，用毛细管将其移至另一试管中，并在该液中加盐酸液(1mol／L)约1ml，振摇后，静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色，即为阳性；无粉红色出现，为阴性反应。对阴性反应的培养物，应再接种PDP琼脂斜面，置36±1℃培养2～3天后，再行检查。
凡氧化酶试验阳性、绿脓菌素阳性及革兰氏阴性杆菌的培养物，可作出检出绿脓杆菌的报告。
上述试验结果中，绿脓菌素阴性反应的培养物，应继续进行以下试验。
3.4.3 硝酸盐还原产气试验 以接种环沾取普通肉汤琼脂斜面培养物，接种于硝酸盐胨水培养基中，置36±1℃培养24小时，观察结果。如在培养基的小倒管中有气体产生，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
3.4.4 42℃生长试验 以接种环挑取普通肉汤琼脂斜面培养物于灭菌盐水中，制成菌悬液，然后取菌悬液接种于肉汤琼脂斜面上，立即置41±1℃水浴箱中培养24～48小时，斜面若有菌苔生长者为阳性；反之为阴性。
3.4.5 明胶液化试验 以接种针沾取普通肉汤琼脂斜面培养物，穿刺接种于明胶培养基内，置36±1℃培养24小时，取出放冰箱内10～30分钟。如培养基仍呈溶液状，即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者，为阴性反应。
4.结果报告
4.1 被检样品培养物，经证实为革兰氏阴性杆菌、氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告检出绿脓杆菌。
4.2 若氧化酶试验阳性的革兰氏阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验为阴性时，硝酸盐还原产气试验，42℃生长试验及明胶液化试验皆为阳性，亦应报告检出绿脓杆菌。
4.3 与4.1及4.2的结果不符时，报告未检出绿脓杆菌。
绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌的主要特性鉴别表性。
金黄色葡萄球菌检验法金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属细菌。本菌在自然界分布甚广，空气、土壤、水和日常用具，人的皮肤、鼻咽腔、痰液、鼻涕、毛囊等常可发现，故在生产各环节中极易污染药品。本菌是葡萄球菌中致病力最强的一种，能引起局部及全身化脓性炎症，严重时可导致败血症。故外用药品和一般眼科制剂规定不得检出金黄色葡萄球菌。
1.培养基、试剂
1.1 普通肉汤培养基(附录三1)
1.2 亚碲酸钠北沙参胨水(附录三27)
1.3 亚碲酸钠肉汤(附录三26)
1.4 卵黄高盐琼脂(附录三28)
1.5 甘露醇高盐琼脂(附录三29)
1.6 普通肉汤琼脂(附录三2)
1.7 血浆(1∶1)(附录二4)
2.检验程序
↓
↓
36±1℃ ↓ 24小时
36±1℃ ↓24～48小时
36±1℃ ↓ 24小时
↓
3.操作步骤
3.1 增菌培养 取供试液(总则5)10ml，接种于备妥的100ml亚碲酸钠肉汤或亚碲酸钠北沙参胨水增菌液(滴眼剂、化学药品供试液可接种普通肉汤)，置36±1℃培养24小时。
含有抑菌成分的滴眼剂等液体制剂，可取样2ml，采用薄膜过滤法(总则5.3.2)，将滤膜分成2片，分别接种2瓶100ml上述增菌液中(与绿脓杆菌同时检验时，取样4ml，过滤后将滤膜剪成4片，分置于二种增菌液4瓶中)，其中1瓶加入规定量的对照菌作阳性对照试验，置36±1℃培养18～24小时。若有菌生长，增菌液变混。
3.2 分离培养 轻微摇动增菌培养液，以接种环沾取1～2环，划线接种于卵黄高盐琼脂或甘露醇高盐琼脂平板，置36±1℃培养24～72小时。
金黄色葡萄球菌在上述平板上的典型菌落形态见表8金黄色葡萄珠菌在选择培养基上的菌落特征金黄色葡萄球菌在上述培养基上产生的色素，典型者为金黄色，但有的菌株可因来源不一或受药物影响，可呈橙黄、黄、白或无色。培养基存放时间和培养时间长短对色素产生亦有影响，一般以新配培养基、培养时间较长，金黄色色素较明显。
上述平板中若无菌落生长，可作出“未检出”报告。若有菌落生长，以接种针轻轻接触疑似菌落中心部位沾取培养物，接种于普通肉汤琼脂斜面，于36±1℃培养18～24小时。一般宜挑取2个以上疑似菌落进行鉴定。
3.3 革兰氏染色镜检 取普通肉汤琼脂斜面培养物涂片，革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，无芽孢，无荚膜，排列呈不规则、堆积似葡萄状。
3.4 生化试验
3.4.1 血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支，每管加入0.5ml1∶1血浆，吸取待检菌的肉汤培养液(或取肉汤琼脂斜面上的纯菌苔少许在生理盐水管中磨匀，使呈浓菌液)0.5ml，加入1支血浆管中，其余2支血浆管作对照管，1支加入阳性对照菌的肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照；另1支加入肉汤或生理盐水0.5ml作阴性对照。将3管同时放在36±1℃培养。3小时后开始检查，以后每隔适当时间观察1次，直至24小时。检查时，轻轻将试管倾斜，仔细观察，凡阴性对照管的血浆流动自如，试验管血浆凝固者为阳性反应；经保温24小时，试验管无凝固现象为阴性反应。每次试验，阳性对照管应出现血浆凝固，阴性对照管应不凝固。否则，应另制备血浆，重新试验。
4.结果报告
4.1 供试品中分离培养物为革兰氏阳性球菌，血浆凝固酶试验阳性，报告检出金黄色葡萄球菌。
4.2 不符合上述试验结果，报告未检出金黄色葡萄球菌葡萄球菌属的菌种生化鉴别d有不同反应结果破伤风杆菌检验法破伤风杆菌为梭状芽孢杆菌属细菌，广泛分布于土壤及人、畜的粪便中。本菌的芽孢对热抵抗力很强，湿热100℃1小时尚能存活，干热150℃1小时尚能存活，在尘埃和土壤中可存活10多年。以根茎类植物为原料的药品常可受到本菌污染，外用药特别是用于深部组织的药品污染破伤风杆菌，可导致破伤风病，死亡率很高。因此，对于某些用于阴道、创伤、溃疡的药品，必须控制破伤风杆菌。
1.培养基、试剂
1.1 0.1％葡萄糖疱肉培养基(附录三 31)
1.2 新霉素葡萄糖血琼脂(附录三 35)
1.3 1％葡萄糖血琼脂(附录三 33)
1.4 革兰氏染色液(附录二 1)
1.5 厌氧指示剂(附录二 3)
1.6 破伤风抗毒素
2.检验程序：(见下页)
3.操作步骤
3.1 增菌产毒培养 称取供试品0.5g，共3份，分别加至0.1％葡萄糖庖肉培养基中(如非当日配制，应于临用前煮沸5分钟，迅速冷却)，其中一管约加0.05ml经36±1℃厌氧培养2～3天的阳性对照菌液。以上各管均置75～80℃水浴保温20分钟，然后置36±1℃厌氧培养(厌氧培养箱、罐、袋。或以1∶1凡士林石蜡封盖疱肉培养基液面)72～96时，观察结果。若培养液产气、消化碎肉并有臭气，应作革兰氏染色镜检和毒力试验。不产气、无消化碎肉及臭气等现象，镜检未见疑似菌者，可作出未检出破伤风杆菌报告。
3.2 革兰氏染色镜检 取增菌产毒培养液涂片，作革兰氏染色镜检。典型的破伤风杆菌应为革兰氏阳性鼓槌样芽孢杆菌，菌体细长，成熟芽孢为正圆形，孢径大于菌体宽度，位于菌体一端，形似鼓槌状；未成熟芽孢为卵圆形，形似火柴或网球拍状，亦可见到游离散在的圆形芽孢。本菌培养时间较久，常为革兰氏染色阴性。
、臭气、消化碎肉，镜检阳性 无产气、臭气、消化碎肉，
镜检阴性
↓
↓
阴性
阳性 阴性
↓ ↓
3.3 毒力试验 选用16～18g或18～22g同性无孕健康小白鼠18～30只，分成3群(供试品2群，阳性对照1群)每群分成2组，每组3～5只，分别作产毒试验及破伤风抗毒素保护试验。
试验组：于小白鼠后腿内侧肌肉或背侧颈部皮下注射增菌产毒培养液0.3～0.5ml，注射6小时后，即可开始观察发病情况至48小时。
由破伤风外毒素引起的症状为小鼠强直性痉挛，抽搐。呈现弓背反张，腿部强直，尾巴竖立等症状，最后死亡。
抗毒素保护试验组：为证实小白鼠的上述症状是否由破伤风毒素所致，应与试验组同时进行破伤风抗毒素保护试验。先以注射用水稀释破伤风抗毒素使成120u.／ml，再以1ml注射器吸取0.3～0.5ml与增菌产毒培养液等量混合后注射小白鼠；或先注射抗毒素，再于半小时内注射增菌产毒培养液6小时后与试验组同时观察结果(作小鼠毒力试验的适宜温度应为15～30℃)。若试验组小鼠呈现上述症状，保护试验组小鼠无上述症状而存活(破伤风毒素被抗毒素中和)，即为毒力试验阳性。
试验组和保护试验组小鼠均未呈现上述症状时，则为毒力试验阴性。
若第一次毒力试验为阴性，镜检发现疑似破伤风杆菌者，应再连续进行二次转种0.1％葡萄糖疱内培养基，每次均于36±1℃厌氧培养72～96小时，再分别进行毒力试验(或仅在第二次转种培养后，做毒力试验)，任一次毒力试验出现阳性结果，均可作出检出破伤风杆菌报告。
3.4 分离培养 如镜检到疑似菌，而毒力试验阴性者，可将增菌产毒培养液划线接种于新霉素葡萄糖血琼脂(或血琼脂)平板，置36±1℃厌氧培养3～4天。破伤风杆菌在上述平板上的血型菌落呈不规则形状，中心紧密、略突起，周边扩散成疏松的细丝状或蔓延生长呈雾状，灰白色、半透明，常有β溶血环。
若出现上述疑似菌落，应转种0.1％葡萄糖疱内培养基中，置36±1℃厌氧培养72～96小时，再作毒力试验。
4.结果报告 镜检有疑似破伤风杆菌，毒力试验阳性，报告检出破伤风杆菌。镜检不论发现或未发现疑似破伤风杆菌，但毒力试验为阴性者，则均报告“未检出”破伤风杆菌。
注意：
(1)凡进行破伤风杆菌检验人员，应事先注射破伤风类毒素预防。
(2)操作时勿损伤皮肤。若有损伤，应立即注射破伤风抗毒素，以防感染。
活螨检验法螨，属于节肢动物门，蛛形纲，蜱螨目，种类繁多，分布甚广。其生活习性各异，营自由生活或寄生生活。在土壤、池沼、江河和湖海里，动、植物体上，贮藏食品和药品中，都可能有它们的存在。
药品可因其原料、生产过程或包装、运输、贮存、销售等条件不良，受到螨的污染。
螨可蛀蚀损坏药品，使药品变质失效，并可直接危害人体健康或传播疾病。例如中成药中发现的腐食酪螨等，对人具有致病力。能引起皮炎及消化系统、泌尿系统、呼吸系统的疾病。因此，用于口服药品及创伤、粘膜和腔道等外用含中药的制剂规定不得检出活螨。
1.设备和材料
1.1 显微镜，双筒实体显微镜
1.2 放大镜
1.3 解剖针、发丝针、小毛笔。
1.4 载玻片及盖玻片
1.5 酒精灯
1.6 培养皿或小搪瓷盘(内衬黑色)
1.7 30％甘油水(简称甘油水)
2.活螨的一般检验法
2.1 螨的形态特征螨的体形微小，多在1mm以下。一般呈卵圆形或椭圆形，无头、胸、腹界限。幼螨足3对，若螨足四对，成螨足多数为四对。足通常由6节组成。口器向前端突出，螯肢常呈螯钳状，有齿，由2～3节组成。须肢节数因种类而异，由1～2节到5节组成，一般呈爪或钳状，偶尔为长形。
有些种类在躯体前端或两侧有1～2对眼。躯体两侧对称，表面被有坚硬的几丁质的板，保护其内部器官和支持肌肉固定。体表有刚毛，它的形状、数目及彼此间长短比例和排列位置因种类而异。
螨类与蜘蛛、昆虫(如书虱)，外形比较近似，因此，必须注意它们之间的主要区别，见表100 螨与蜘蛛、昆虫主要形态鉴别
2.2 检验方法
2.2.1 直检法：取供试品先用肉眼观察，有无疑似活螨的白点或其它颜色的点状物，再用5～10倍放大镜或双筒实体显微镜检视，有螨者，用解剖针或发丝针或小毛笔挑取活螨放在滴有一滴甘油水的载玻片上，置显微镜下观察。
2.2.2 漂浮法：将供试品放在盛有饱和食盐水的扁形称量瓶或适宜的容器内，加饱和食盐水至容器的2／3处，搅拌均匀，置10倍放大镜或双筒实体显微镜下检查，或继续加饱和食盐水至瓶口处(为防止盐水和样品溢出污染桌面，宜将上述容器放在装有适量甘油水的培养皿中)，用洁净的载玻片盖在瓶口上，使玻片与液面接触，沾取液面上的漂浮物，置显微镜下检查。
2.2.3 分离法：也称烤螨法。将供试品放在特制的分离器或附有孔径大小适宜的筛网的普通玻璃漏斗里，利用活螨避光、怕热的习性，在漏斗的广口上面放1个60～100w的灯泡，距离药品约6cm处，照射1～2小时。活螨可沿着漏斗内的底部细颈内壁向下爬，用小烧杯装半杯甘油水，放在漏斗的下口处，收集爬出来的活螨。
3.各剂型药品的活螨检验方法供试品取样量：各剂型供试品，每批应抽取两瓶或两盒以上的包装单位；贵重或微量包装的供试品，取样量可酌减。必要时，可再次抽样，或选取有疑问的样品进行检验。
3.1 大蜜丸：将药丸外壳(蜡壳或纸蜡壳等)置酒精灯小火焰上转动，适当烧灼(杀灭外壳可能污染的活螨)后，小心打开。
3.1.1 表面完好的药丸，可用消毒的解剖针刺入药丸，手持解剖针，在放大镜或双筒实体显微镜下检查。同时注意检查丸壳的内壁或包丸的油纸有无活螨。
3.1.2 有虫粉现象的药丸，可用放大镜或双筒实体显微镜直接检查，也可用漂浮法检查。
3.2 小蜜丸、水丸和片剂
3.2.1 表现完好的丸、片，可将药品放在预先衬有洁净黑纸的培养皿或小搪瓷盘中，用直检法检查。如未检出螨时，认为有必要，也可再用漂浮法或烤螨法检查。
3.2.2 有虫粉现象的丸、片，可用直检法或漂浮法检查。同时注意检查药瓶内壁与内盖有无活螨。
3.3 散剂、冲剂和胶囊剂等先直接检查药瓶内盖及塑料薄膜袋的内侧有无活螨。后将药品放在衬有洁净黑纸的搪瓷盘里，使成薄层，直接检查。必要时，可再用漂浮法检查。并注意检查药瓶内壁是否有螨。
3.4 块状冲剂直接检查供试品的包装蜡纸、玻璃纸或塑料薄膜及药块表面有无活螨。
有虫粉现象者，除用直检法检查外，再用漂浮法检查。
3.5 液体制剂及半固体膏剂先用75％酒精将药瓶的外盖螺口周围消毒后小心旋开外盖，用直检法，检查药瓶外盖的内侧及瓶口内外的周围与内盖有无活螨。
3.6 除上述以外的其它剂型可视具体情况参照上述有关方法检查。
4.活螨卵(如腐食酪螨卵)的检验方法螨卵极小，一般在0.1mm以下，呈乳白色，椭圆形或卵圆形。须用10～20倍放大镜或显微镜方可查见。螨卵常见于活螨群的周围，但在未检出活螨的样品中，亦有检出螨卵者。一般在供试品中已经检出活螨的，不再进行螨卵的检查。对可疑供试品，未检出活螨时，可注意检查活螨卵。
检验方法：可采用检验活螨项下的直检法或漂浮法检查。凡用上述两种方法检查，如发现可疑螨卵时，用发丝针小心挑取。取一块凹形载玻片，在凹窝中央滴入2滴甘油水，将挑取物放入甘油水中，置显微镜下检查。
为确证挑取物是否为活螨卵，可将上述载玻片置培养皿中，加盖，于22～30℃培养3～8天，每天上、下午定时用低倍显微镜观察，如在甘油水液中孵出幼螨，则判断为检出活螨卵。
5.供试品检验报告凡供试品按上述有关剂型项下规定检验，发现活螨者，应作检出活螨报告。
在供试品中未检出活螨，但检出活螨卵时，可按检出活螨处理。
为保留阳性结果备查，可将检出的螨按下法处理保存：将活螨挑放在载玻片上预先滴有1滴75％乳酸溶液中，加上载玻片。手持载玻片，在酒精灯小火焰上来回移动，缓缓加热片刻，使其适当透化，即可镜检。鉴定后的螨体，可取下放入70％酒精中保存，或适当处理。
发丝针的制作：取长约1.5cm的头发丝一根和长约10cm的小金属棒1根，以头发丝长度的一半紧贴在金属棒的一端，用细棉线将其缠紧，然后粘上加拿大树胶或油漆，晾干，即得。
无菌检查法(中国药典1990年版)无菌检查法系指检查药品与敷料是否无菌的一种方法。
无菌检查的全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物的污染。
生物制品应按《生物制品制造及检定规程》中有关无菌检查的规定办理。
培养基及其制备方法
1.需气菌、厌气菌培养基(液体硫乙醇酸盐)
酪胨(胰酶水解) 15g
葡萄糖 5g
硫乙醇酸钠 0.5g
(或硫乙醇酸 0.3ml)
酵母浸出粉 5g
氯化钠 2.5g
新鲜配制的0.1％刃天青溶液 1.0ml
(或新鲜配制的0.2％亚甲蓝溶液 0.5ml)
琼脂 0.5～0.7g
蒸馏水 1000ml
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成份加入水内，微温溶解后，PH为弱碱性，煮沸、滤清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，摇调节PH值使灭菌后为7.1±0.2，分装，115℃灭菌30分钟
2.霉菌培养基
蛋白胨 5g
葡萄糖 10g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 1g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g
蒸馏水 1000ml
除葡萄糖外，取上述成份加入水内，微温溶解后，调节PH约0，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节PH值使灭菌后为5.8.2，分装，115℃灭菌30分钟。
3.选择性培养基
(1)对氨基苯甲酸培养基(用于碘胺类药物的无菌检查)照上述液体硫乙醇酸盐培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后摇匀，分装，115℃灭菌30分钟。
(2)吐温培养基(用于油剂药品的无菌检查)照上述液体硫乙醇酸装，115℃灭菌30分钟。
4.普通肉汤培养基
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
肉浸液 1000ml
取蛋白胨、氯化钠，加入肉浸液内，微温溶解后，调节PH为弱碱煮沸、滤清，调节PH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌
分钟。
5.普通肉汤琼脂培养基
照上述普通肉汤培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
6.0.5％葡萄糖肉汤培养基
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
葡萄糖 5g
肉浸液 1000ml
取蛋白胨与氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节PH为弱碱煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节PH值使灭菌后为PH2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
上述培养基分别按15ml与40ml分装于试管中，装量为试管高度的2／5，然后按上述温度、时间灭菌。细菌培养基经30～35℃培养48小时，霉菌培养基经20～25℃培养后，应无菌生长。
培养基的质量应通过以下检查
(1)液体硫乙醇酸盐培养基经接种1ml含100个以下的藤黄八叠球菌(CMCC(B)28001)的菌液，置30～35℃培养24小时后，应生长良好。
(2)液体硫乙醇酸盐培养基经接种1ml含50个以下的生孢梭菌(CMCC(B)64941)的菌液，置30～35℃培养24小时后，应生长良好。
(3)霉菌培养基经接种1ml含50个以下的白色念珠菌菌液，置20～25℃培养24小时后，应生长良好。
(附注)肉浸液制备法：取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后，每1000g加水3000ml，充分拌匀，在2～10℃浸泡20～24小时，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补足液量，分装，121℃灭菌30分钟，置冷暗处备用。也可用牛肉浸膏3g，加水1000ml，配成溶液代替。
对照用菌液
金黄色葡萄球茵(Staphylococcus aureus)菌液：取金黄色葡萄球茵(CMCC(B)26003)的普通肉汤琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至液体硫乙醇酸盐培养基内，在30～35检查法
1.供试品如为注射液，供角膜创伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液。
任取供试管2支(瓶)以上，用适当消毒液清洁供试品容器的外表面，以无菌操作吸取规定接种量的供试品溶液，分别接种于液体硫乙醇酸盐培养基5管，其中1管接种金黄色葡萄球菌菌液1ml，供作阳性对照；另接种于霉菌培养基2管。供试品溶液的每管接种量与培养基的分装量，应根据供试品的装量，接下列规定取用：
供试品装置 每管接种量 培养基分装量
ml或2ml以下 0.5ml 15ml
ml以上至20ml 1.0ml 15ml0ml以上
5.0ml 40ml接种后轻轻摇动，使匀，液体硫乙醇酸盐培养基在30～35℃培养5日，霉菌培养基在20～25℃培养7日，抗生素药品培养7日，放射性药品培养8～14日，培养期间应逐日检查是否有菌生长(阳性对照在24小时内应有细菌生长)；如在加入供试品溶液后，培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时，可取该培养液接种另1支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48～72小时后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。
2.供试品如为注射用灭菌粉末或冷冻干燥的无菌制品。照该药品项下的规定或按药品“剂量”项下的溶剂用量，加入灭菌的水或灭菌生理盐水，使内容物溶解成均匀的供试品溶液，取规定接种量的供试品溶液，接种于上述培养基中。
3.供试品如为直接供分装注射用的原料药品。按各该药品项下的规定制成溶液，依法接种于培养基中。
4.供试品如为外科敷料。取供试品2个包装，以无菌操作拆开包装，于不同部位剪取约1cm×3cm的样品，分别接种于40ml培养基中。
5.供试品如有抑菌作用或含有抑菌物质时，可选用适宜的培养基，或种入较大量的培养基中，使该供试品稀释至不具有抑菌作用的浓度，或照下述“薄膜过滤法”处理并接种于培养基中。
6.供试品如为抗生素药品。取供试品不少于2瓶(支)或2份(原料药)，分别按该药品项下规定的方法处理后，种入每管装量为40ml的培养基中，分别依法检查。
(1)青霉素酶法 取规定量的供试品，加入足够使青毒素灭活的无菌青霉素酶溶液，使成约10ml，分别等量接种于培养基中。
(2)薄膜过滤法 取规定量的供试品，加入灭菌生理盐水100ml或其他适宜的溶剂中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm，孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内，减压抽干后，用灭菌生理盐水或其他适宜的溶剂冲洗薄膜3次，每次100ml。取出薄膜，分成4片，取3片分别放在3管液体硫乙醇酸盐培养基中，其中1管接种金黄色葡萄球菌菌液1ml，供作阳性对照，另1片放在霉菌培养基管中。
7.供试品如为放射性药品 取供试品1瓶(支)，以每管接种量为0.2ml，接种于每管装量为7.5ml的培养基中。
结果的判断
当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长时，可根据观察所得结果判定：
如液体硫乙醇酸盐及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格。如液体硫乙醇酸盐及霉茵培养管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法复试2次，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。
附：第一条 常用检验设备及器材
培养箱 30～35℃ 36±1℃
培养箱 25～28℃
水浴箱 45±1℃
工作台
显微镜 1500×
显微镜或放大镜箱
干燥箱 250～300℃
蒸汽消毒器
天平
仪或研钵
瓶 100ml，250ml，500ml
吸管 1ml，
10ml
13×100mm，
18×180mm，30×200mm
皿 9cm
盖 12cm
100ml，500ml，1000ml及微届滤膜(孔径0.45±0.02μm)器 1ml，5ml，10ml，30 ml片及盖玻片
针及接种环
架
灯
第二条 染色法 稀释剂 指示剂及试剂
1.染色法
1.1 革兰氏染色法
1.1.1 染液配制
(1)结晶紫染液：
结晶紫(Cystal violet) 1.0g
95％乙醇 20ml
1％草酸铵[(NH4)2C2O4]水溶液 80ml
将结晶紫溶解于95％乙醇中后，与草酸铵溶液相混合，静置48使用。此染液稳定，置密闭的棕色瓶中可储存数月。
(2)革兰氏碘液：
碘片[I2] 1.0g
碘化钾[KI] 2.0g
蒸馏水 300ml
先用3～5ml蒸馏水溶解碘化钾，再加入碘片，待全部溶解后，加蒸馏水稀释至300ml。置密闭棕色瓶中，备用。
(3)脱色液：95％乙醇
(4)沙黄(番红)染液
沙黄(Saframine O) 0.25g
95％乙醇 10ml
蒸馏水 适量
将沙黄溶解于95％乙醇中，待完全溶解再加蒸馏水至100ml。
1.1.2 染色法
(1)用接种环沾取无菌水，置于洁净载玻片上，再挑取少许菌苔，轻轻研开，使均匀。
(2)涂片自然风干或微热烤干，而后通过火焰2～3次以固定涂片。
(3)滴加结晶柴染液，染色1分钟，水洗 。
(4)滴加碘液、媒染1分钟，水洗、甩干余水。
(5)滴加95％乙醇脱色，约20～30秒，或将95％乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满涂片脱色10秒钟，水洗、吸干。
(6)滴加沙黄复染液，染1分钟，水洗，待干。
(7)镜检
1.1.3 染色结果
革兰氏阳性菌呈蓝紫色
革兰氏阴性菌呈红色
1.1.4 注意事项
(1)玻片必须洁净，涂片宜薄而匀，菌量不可浓，否则，看不清单个菌体形态。
(2)待检菌菌龄以18～24小时为宜，革兰氏阳性茵易受菌龄影响，老化细胞易呈阴性。
(3)脱色是本法的关键步骤，脱色不足易染成阳性，脱色过度易染成阴性。
1.2 鞭毛染色法
1.2.1 染液配制
(1)甲液：
鞣酸(丹宁酸) 5.0g
氯化铁(FeCl3) 1.5g
15％甲醛 2.0ml
1％氢氧化钠(NaOH) 1.0ml
蒸馏水 100ml
先将鞣酸、氯化铁溶于蒸馏水中，再加入氢氧化钠与甲醛液
(2)乙液：
硝酸银(AgNO3) 2.0g
蒸馏水 100ml
取出10ml硝酸银溶液，备用。向余下90ml硝酸银溶液滴加浓氢氧化铵[NH4OH]，使现浓厚的沉淀，再继续滴加至刚出现澄清状态为止。再将备用硝酸银溶液谨慎地逐滴滴加到已澄清的溶液中，此时呈现薄雾；轻摇则消失，继续边滴加边摇动，使澄清液略显不消散的薄雾为止。
如雾重，则银盐沉淀，不宜使用。
1.2.2 染色法
(1)将待检菌事先接种于新制备的普通肉汤琼脂斜面上，置37℃培养16～20小时。
(2)在洁净无痕的载玻片中部及与之相隔斜上1cm处，用接种环沾取一环蒸馏水，然后用接种环从待检菌斜面湿润处挑取培养物少许于斜上方的水滴中，略倾斜玻片，使上位水滴自然流动至中部水滴中，使培养物自然扩散至中部水滴中，前后操作均不应研磨或搅动，任其自然干燥。
固定。
(3)在干燥涂片上加甲液。染3～5分钟，用蒸馏水轻轻冲洗，将残水沥干或用乙液冲去残水后，加适量乙液，保持30～60秒钟，染色时宜在酒精灯上适当加温，使染液出现蒸气为宜，勿使出现干燥。蒸馏水冲洗。
(4)镜检：在菌体分布均匀、清晰处观察。
1.2.3 染色结果：菌体及鞭毛皆染成茶色。
1.2.4 注意事项
(1)染液随用随配、隔日效果则差。
(2)一定要充分洗净甲液后，再加乙液，否则背景较脏。
(3)防止水及培养物沾有氯化物。
(4)切忌用接种环涂研培养物。
(5)玻片要洁净，不得有油污。玻片应先在含洗衣粉的水中煮沸，玻片间不应重叠，以免去污不净。煮后水洗，放置于清洁液中，浸泡24小时，取出充分水洗，除去残酸，沥干，存放于95％乙醇中备用。玻片洁净与否对本染色极为关键。
(6)染色过程中加温最好置于金属板上均匀加温。
1.3 芽孢染色法
1.3.1 染液配制
(1)石炭酸复红液
碱性复红(Fuchsin basic ) 0.4g
95％乙醇 10ml
5％酚溶液 90ml
将碱性复红溶于95％乙醇中后，与5％酚溶液90ml相混合。
(2)碱性美蓝(亚甲蓝)溶液
美蓝(Methylene blue) 0.6g
95％乙醇 30ml
0.01％氢氧化钾(KOH)水溶液 100ml
将美蓝溶于95％乙醇中后，与0.01％氢氧化钾水溶液100ml相。
1.3.2 染色法
(1)涂片、干燥、固定。
(2)滴满石炭酸复红染液并于酒精灯火焰上加热，使染液冒气约5分钟，待冷，水洗，并用95％乙醇脱色30秒钟，水洗，再加碱性美蓝溶液染色30秒钟，水洗、待干。
(3)镜检
1.3.3 染色结果
芽孢为红色、菌体为蓝色
1.3.4 注意事项：加热时勿使染液干涸，可续加石炭酸复红染液。
1.4 乳酸复红染色法
1.4.1 染液配制
酸性复红(Fuchsin acid) 0.1g
乳酸 100ml
将两份混合、溶解即得。
1.4.2 染色法：滴加染液于载玻片上，挑取待检菌于染液中，置显微镜下观察。真菌菌丝染成淡红色。
1.4.3 用途 供真菌菌丝体染色或镜检时介质用。
1.5 乳酸棉蓝染色液
1.5.1 染液配制
苯酚 20.0g
乳酸 20.0ml
甘油 40ml
棉蓝(苯胺蓝(水溶))(Cotton blue) 0.05g
蒸馏水 20ml
将酚、乳酸、甘油混合，徐徐加热溶解后，加入棉蓝混匀溶解。
1.5.2 染色法 滴加染液于载玻片上，挑取待检菌于染液中，置显微镜下观察。真菌菌丝染成蓝色。
1.5.3 用途 供真菌染色用。若不加棉蓝即为乳酸苯酚液，可供作霉菌镜检时的介质。
2.稀释剂
2.1 生理盐水
氯化钠 9g
蒸馏水 1000ml
称取氯化钠，加水溶解，分装后于121℃高压灭菌20分钟。供作剂或冲洗剂用。
2.2 PH7.2磷酸盐缓冲液(0.1mol／L)
磷酸氢二钠(Na2HPO4、12H2O) 25.8g
磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) 4.4g
蒸馏水 1000ml
将以上成份混合，搅拌使溶，PH应为7.1～7.3，分装后于121℃高压灭菌20分钟。供作稀释剂或冲洗剂用。
2.3 PH6.8磷酸盐缓冲液(0.2mol／L)
磷酸氢二钾液(0.2mol／L)：称取磷酸氢二钾27.2g，加水使溶解成1000ml
氢氧化钠液(0.2mol／L)：称取氢氧化钠8.0g，加水使溶解成1000ml
取磷酸氢二钾液(0.2mol／L)250ml，加氢氧化钠液(0.2±mlo／L)118ml加水稀释至1000ml。分装后于121℃高压灭菌20分钟。供作肠溶胶囊(片)剂稀释剂用。
高压灭菌20分钟。供作稀释剂或冲洗剂用。
3.指示剂
3.1 0.5％酸性复红指示剂(Andrade指示剂)
3.1.1 配制
酸性复红 0.5g
蒸馏水 100ml
取酸性复红0.5g，溶于100ml蒸馏水中，逐渐加入氢氧化钠溶液(1mol／L)16ml，每加入1滴碱液时，应将溶液充分摇匀后，再滴入第二滴，直至溶液呈草黄色。于沸水浴内保持15分钟，静置2小时，用滤纸滤过，滤液存放在棕色瓶中，暗处保存备用。
3.1.2 用途：可供作指示剂，变色范围PH6.0～7.4(黄～红)。
3.2 1％、0.2％、0.02％酚红溶液(P、R)
3.2.1 配制
酚红(Phenol red) 1.0g
蒸馏水 适量
取酚红1.0g，加入氢氧化钠溶液(1mol／L)2.82ml，使溶解，再加蒸馏水至100ml，为1％酚红溶液。
量取1％酚红溶液10ml，加蒸馏水至50ml，混匀即得0.2％酚红溶液。
3.2.2 用途：1％、0.2％酚红溶液均可供作培养基指示剂，变色范围PH6.8～8.4(黄～红)。0.02％酚红溶液可供PH测定用。
3.3 0.4％、0.04％溴麝香草酚蓝溶液(B.T.B)
3.3.1 配制
溴麝香草酚蓝(Bronthymol blue) 0.4g
蒸馏水 适量
取溴麝香草酚蓝0.4g，加入氢氧化钠溶液(1mlo／L)0.64ml研磨，使溶，加蒸馏水至100ml为0.4％溴麝香草酚蓝溶液。
量取0.4％溶液10ml，加蒸馏水至100ml，混匀，即得0.04％溴麝香草酚蓝溶液。
3.3.2 用途：0.4％溴麝香草酚蓝溶液可供作培养基指示剂，变色范围PH6.0～7.6(蓝～黄)，0.04％溴麝香草酚蓝溶液可供测定PH用。
3.4 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液
3.4.1 配制
溴甲酚紫(Bromcresol purple) 1.6g
95％乙醇 100ml
取溴甲酚紫1.6g溶于乙醇中。
3.4.2 用途：可供作氨基酸脱羧酶培养基指示剂，变色范围P
H5.2～6.8(黄～紫)。
3.5 1％中性红溶液(N.R.)
3.5.1 配制
中性红(Neutral red) 1.0g
95％乙醇 60ml
蒸馏水 适量
取中性红1.0g，研细，加95％乙醇60ml，使溶后，再加蒸馏水至100ml。
3.5.2 用途：可供作培养基指示剂，变色范围PH6.8～8.0(红～黄)。
3.6 美蓝氧化还原指示剂
3.6.1 配制
(1)6％葡萄糖水溶液，取葡萄糖6.0g，加蒸馏水100ml。
(2)取氢氧化钠溶液(0.1mol／L)6ml，加蒸馏水至100ml。
(3)取0.5％美蓝水溶液3ml，加蒸馏水至100ml。
临用时等量混合上述3种溶液，装入试管煮沸，当蓝色褪为无色时，立即置于厌氧培养的容器内。
3.6.2 用途：可供作厌氧培养时作缺氧状况的指示剂。
4.试剂
4.1 靛基质试剂
4.1.1 配制(两法任选其一)
(A)柯凡克氏(Kovac)试剂
对二甲氨基苯甲醛5.0g
戌醇(或丁醇)75ml
浓盐酸25ml
取对二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戌醇，充分振摇，使完全溶解
再取浓盐酸徐徐滴加，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深。
剂应少量配制，置冰箱保存。
对二甲氨基苯甲醛 1.0g
95％乙醇 95ml
浓盐酸 20ml
取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95％乙醇，充分振摇，使完全溶
其后步骤同柯凡克氏试剂。
4.1.2 用途：可供作靛基质反应试剂。
4.2 0.02％甲基红试剂
4.2.1 配制
甲基红(Methyl red) 0.1g
95％乙醇 300ml
蒸馏水 适量取甲基红0.1g，加入95％乙醇，使溶后，再加蒸馏水至500ml。
4.2.2 用途：可供作甲基红反应试剂
4.3 培立脱氏(Barritt)试剂
4.3.1 配制
甲液：
g
无水乙醇 100ml
乙液：
40％氢氧化钾溶液
氢氧化钾 40.0g
蒸馏水 100ml
分别将各试药溶入各溶剂中，即得。
4
3000
4.4.1 配制
虎红(孟加拉红Rose Bengal，四氯四碘荧光素Tetraium) 0.1g
蒸馏水750ml
取虎红0.1g，溶于蒸馏水中。
4.4.2 用途：可供制备霉菌培养基，用以抑制细菌及放线菌生
4.5.1 配制
0.1gloride)
蒸馏水
4.5.2 用途：可供制备培养基用。
4.6 0.1％煌绿(亮绿)溶液
4.6.1 配制
煌绿(Brilliant Green) 0.1g
蒸馏水 100ml
取煌绿0.1g溶于蒸馏水中
4.6.2 用途：可供制备培养基用。煌绿溶液具抑菌作用，配制后10日内用毕，久存失效。
4.7 1％亚碲酸钠(钾)溶液
4.7.1 配制
亚碲酸钠(钾) 0.1g
蒸馏水 100ml取亚碲酸钠(甲)0.1g，加至新鲜煮沸后冷至50℃的热蒸馏水使溶。
4.7.2 用途：可供制备培养基用，本溶液具抑菌作用，应临用现
4.8 2％伊红Y溶液
4.8.1 配制
伊红Y(Eosiny) 2.0
g
蒸馏水 100m
l
取伊红2.0g，溶于100ml蒸馏水中。
4.8.2 用途：可供制备培养基用。
4.9 0.5％美蓝溶液
4.9.1 配制
美蓝 0.5g蒸馏水 100ml取美蓝0.5g溶于100ml蒸馏水中，即成0.5％美蓝溶液。
4.9.2 用途 供制备培养基用
4.10 20％尿素无菌溶液
4.10.1 配制
尿素 20.0g
蒸馏水 100ml
取尿素20.0g，加蒸馏水100ml，充分摇匀使溶后，用除菌器滤过，将无菌滤液置入无菌容器中即得，或将尿素溶液加入麝香草酚1g，在室温放置1～2天，亦可使用。配制时须无菌操作。
4.10.2 用途：可供制备培养基用。
4.11 1％盐酸二甲基对苯二胺试液
4.11.1 配制ydrochloride )0.1g，溶于蒸馏水10ml即得。此液应新鲜少量配制，于冰箱内避光保存。如试液变成红褐色，不可使用。
4.11.2 用途 氧化酶试验用
4.12 盐酸试液 (1mol／L)
4.12.1 配制量取浓盐酸(以比重1.19，含量36％计)8.4ml，加蒸馏水至100ml，混匀即可。
4.12.2 用途 绿脓菌素测定用
4.13 血浆的制备
4.13.1 抗凝剂 5％柠檬酸钠生理盐水，称取柠檬酸钠0.5g，加入10ml生理盐水内，121℃灭菌20分钟，备用。
4.13.2 器材 注射器、针头、镊子、带塞试管及离心管等，经160℃干热灭菌2小时，备用。
4.13.3 采血 家兔、羊及人血均可。从家兔心脏采血时，将其固定在解剖架上，剪去左胸部心脏跳动处的兔毛，先以碘酒充分消毒，再用酒精擦去碘酒。然后将灭菌注射器装好针头，以无菌手续吸取柠檬酸钠抗凝剂约1ml，穿刺家兔左胸部的肋间抽取心脏血液约9ml轻轻混匀数分钟。待血液不凝固时，徐徐放入灭菌离心管，置离心机内，以每分钟1500转速度离心沉淀10分钟。用灭菌吸管仔细吸取血浆，移至灭菌试管中，置冰箱内备用。已出现凝块的血液或血浆不得供凝固酶试验用。
制备好的家兔血浆，应用已知血浆凝固酶试验阳性的金黄色葡萄球菌，按凝固酶试验法测试。经试验为阳性反应，证明血浆合格，方可用于试验。
4.14 1％对氨基苯甲酸溶液
4.14.1 配制g，加入含10ml蒸馏水的带塞试管中，121℃灭菌20分钟，备用。
4.14.2 用途 供磺胺类药物检验用。
第三条 培养基本方法中使用的培养基可按下列配方制备，亦可使用相应配方的干燥培养基。
1.普通肉汤培养基
1.1 成分
牛肉浸液(1∶3) 1000ml
蛋白胨 10g
氯化钠 5克
PH7.4
1.2 制法 将上述成分混合，加温使溶，校正PH，煮沸，过滤。
锥形瓶或小试管，121℃灭菌20分钟。
1.3 用途 增菌培养用注：牛肉膏3g加蒸馏水1000ml使溶可代替牛肉浸液(1∶3)00ml
2.普通肉汤琼脂培养基
2.1 成分
牛肉浸液(1∶3) 1000ml
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
琼脂 15～20g
PH7.4
2.2 制法 将胨、氯化钠、加入牛肉浸液内，加热溶解，校正PH，加入琼脂，煮沸，使琼脂溶化。分装锥形瓶或试管，121℃灭菌20分钟。趁热摆成斜面备用。
2.3 用途 细菌总数测定，保存菌种及纯培养用。
注：本培养基中琼脂用量需按所用琼脂的凝固力及季节适当增减。用于测细菌总数时，琼脂量略低；用于制备斜面或平板时，其量略高。
3.半固体肉汤琼脂
3.1 成分 同普通肉汤琼脂培养基，其中琼脂用量为0.3％～0.5％其透明度应较好。
3.2 制法 同普通肉汤琼脂培养基。分装13×100mm小试管。121℃灭菌20分钟。
3.3 用途：观察细菌动力用。
4.0.001％TTC肉汤琼脂培养基(0.001％2.3.5氯化三苯四氮唑琼脂)普通肉汤琼脂培养基于用前将其融化，冷至60℃左右加入灭菌的1％2.3.5氯化三苯四氮唑水溶液1ml，摇匀，倾注平皿。
本培养基为细菌总数测定时防止菌落蔓延用。
5.虎红琼脂培养基
5.1 成分
蛋白胨 5g
葡萄糖 10g
磷酸二氢钾 1g
硫酸镁(MgSO4·7H2) 0.5g
琼脂 15～20g
4／3000虎红水溶液 10ml
蒸馏水 1000ml
5.2 制法 除葡萄糖、虎红外，上述各成分混合，加热溶解，再葡萄糖及虎红(四氯四碘荧光素)溶液，混匀。分装锥形瓶，115℃30分钟。
5.3 用途 霉菌总数测定用
6.酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基
6.1 成分
蛋白胨 10g
葡萄糖 20g
酵母膏 5g
琼脂 15～20g
蒸馏水 1000ml
6.2 制法 除葡萄糖外，上述各成分混合，加热使溶。加入葡萄匀。分装锥形瓶，115℃灭菌15分钟。
6.3 用途 蜜浆剂酵母菌数测定用。
7.胆盐乳糖(BL)增菌液
7.1 成分
蛋白胨 20g
氯化钠 5g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 4g
(或K2HPO4·3H2O 5.2g)
磷酸二氢钾 1.3g
牛胆盐 1.3g
(或去氧胆酸钠 0.25g)
乳糖 5g
蒸馏水 1000ml
PH7.4
7.2 制法 除乳糖、胆盐(或去氧胆酸钠)外，将上述其它成分混合，微温使溶，校正PH，加入乳糖、胆盐(或去氧胆酸钠)混匀分装于150ml锥形瓶内，115℃灭菌30分钟。
7.3 用途：用于大肠杆菌和绿脓杆菌的增菌培养。
注：胆盐是抑菌剂，对革兰氏阳性菌有良好的抑菌作用，但用量过大，对大肠杆菌亦有抑菌作用。每1000ml培养基中胆盐用量如下：
牛胆盐、去氧胆酸钠如上述处方量，猪胆盐5g，羊胆盐5g，三号胆盐(Bile salt NO.3)，五号胆盐1.5g。
8.伊红美蓝琼脂(EMB)
8.1 成分普通肉汤琼脂(PH7.4) 1000ml乳糖 10g2％伊红Y水溶液 20ml
0.5％美蓝水溶液 13～16ml
8.2 制法 将乳糖加入肉汤琼脂内，加热融化琼脂，冷至60℃，加入伊红和美蓝灭菌溶液，摇匀，倾注平板，冷凝后备用。
8.3 用途 大肠杆菌及沙门氏菌分离培养用。
9.麦康凯琼脂
9.1 成分
蛋白胨 20g
猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g
氯化钠 5g
琼脂 15～20g
蒸馏水 1000ml
乳糖 10g
1％或0.5％中性红水溶液 2.5或5ml
PH7.2～7.4
9.2 制法 除琼脂、乳糖、胆盐、中性红水溶液外，将其它成分混合，加温溶解，校正PH，加入琼脂，煮沸至琼脂溶化后过滤。加入胆盐乳糖、中性红水溶液，掏匀分装。115℃灭菌30分钟。制成平板备用。注意避光保存。
9.3 用途 大肠杆菌及沙门氏菌分离培养用
10.蛋白胨水培养基
10.1 成分
胰蛋白胨(或多价蛋白胨) 10g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000ml
PH7.2～7.4
10.2 制法 上述各成分混合，加热溶化，校正PH。分装小试
13×100mm)，121℃灭菌20分钟
10.3 用途 供靛基质试验用
11.磷酸盐葡萄糖胨水培养基
11.1 成分
多价胨 7g
磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 5g
葡萄糖 5g
蒸馏水 1000ml
PH7.2～7.4
11.2 制法 上述各成分混合，微温使溶，校正PH，分装小试121℃灭菌15分钟。
11.3 用途 供甲基红及VP试验用。
12.西蒙氏柠檬酸盐培养基
12.1 成分
氯化钠 5g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g
磷酸氢二钾 1g
柠檬酸钠(无水) 2g
琼脂 15～20g
0.4％溴麝香草酚蓝(B·T·B)液 20ml
蒸馏水 1000ml
PH6.8～7.0
12.2 制法 除B·T·B和琼脂外，混合各成分，微温使溶，校正PH，加入琼脂，加热溶化，加入指示剂混匀。分装小试管。121℃灭菌15分钟。放成斜面。
12.3 用途 供柠檬酸盐利用试验用
注：所用琼脂应不舍游离糖，用前可用水浸泡冲洗。
13.糖·醇发酵培培养基
13.1 成分
基础液
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000ml
指示剂
0.5％酸性复红指示剂 10ml
(或0.4％溴麝香草酚蓝 6ml)
糖、醇 0.5％
13.2 制法 胨和氯化钠加入蒸馏水中，微温使用，校正PH，指示剂混匀。分装每瓶100ml，121℃灭菌15分钟。
配制葡萄糖发酵管时，于100ml基础液中加入0.5g葡萄糖，分含小倒管的小试管中；配制其它糖醇发酵管时，将各种糖、醇分成10％溶液，与基础液同时高压灭菌(121℃15分钟)。将5ml糖液加入100ml基础液内，无菌操作分装于灭菌小试管中。
注 糖醇溶液亦可采用滤膜法过滤除菌。
13.3 用途 供鉴别待检菌的糖类发酵反应用。
14.5％乳糖发酵管
14.1 成分
蛋白胨 0.2g
氯化钠 0.3g
磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 0.2g0.4％溴麝香草酚蓝液 0.6ml乳糖 5g
蒸馏水 100ml
PH7.4
14.2 制法 除乳糖和指示剂外，混合各成分，微温使溶，校正，加入乳糖及指示剂混匀，分装于含有小倒管的灭菌小试管中，5℃灭菌15分钟。
14.3 用途 供迟缓发酵乳糖细菌鉴别用。
15.四硫磺酸盐增菌液
15.1 成分
基础液
蛋白胨 5g
胆盐 1g
碳酸钙 10g
硫代硫酸钠 30g
蒸馏水 1000ml
碘溶液
碘 6g
磺化钾 5g
蒸馏水 20ml
15.2 制法 基础液各成分混合，加热溶解，分装每瓶100ml。
时应随时振摇，使其中碳酸钙混匀。121℃灭菌20分钟。
临用前每100ml基础液中加入碘溶液2ml，0.1％煌绿溶液1ml，，分装每管10ml。
15.3 用途 沙门氏菌增菌培养用。
16.三糖铁琼脂(TSI)
16.1 成分
蛋白胨 15g
蛋白□ 5g或蛋白胨5g
牛肉膏 5g
乳糖 10g
蔗糖 10g
葡萄糖 1g
氯化钠 5g
硫酸亚铁 0.2g
硫代硫酸钠 0.2g
琼脂 12～15g
0.2％酚红溶液 12.5ml
蒸馏水 1000ml
PH7.4
16.2 制法 除糖、指示剂、硫酸亚铁和硫代硫酸钠外，以上各成分加入蒸馏水中，加温溶解。加入糖、硫酸亚铁及硫代硫酸钠(后二者先用少量水溶解)，校正PH。加入0.2％酚红水溶液12.5ml，摇匀。分装小试管，装量宜较多。115℃灭菌30分钟。放置高层斜面，凝后置冷暗处保存备用。
16.3 用途 供肠道菌初步鉴别用
17.DHL 琼脂 (Deaxycholate Hydroge
n Sulfide LactoseAgar)
17.1 成分
蛋白胨 20g
牛肉膏 3g
乳糖 10g
蔗糖 10g
去氧胆酸钠 1g
硫代硫酸钠 2.3g
柠檬酸钠 1g
柠檬酸铁铵 1g
中性红 0.03g
琼脂 18～20g
蒸馏水 1000ml
PH7.3
17.2 制法 除中性红、琼脂外，各成分溶解于400ml蒸馏水校正PH，再将琼脂于600ml蒸馏水中煮沸溶解，两液合并，加入5％中性红液6ml，待冷至50～55℃，倾注平板。
17.3 用途 沙门氏菌分离培养用
18.SS琼脂培养基
18.1 成分
蛋白胨 5g
牛肉膏 5g
琼脂 20g
乳糖 10g
胆盐 8.5g
柠檬酸钠(Na3C6H5O72H2O) 8.5g
硫代硫酸钠(Na2S2O35H2O) 8.5g
柠檬酸铁铵 1g
1％中性红水溶液 2.5ml
0.1％煌绿溶液(新配) 0.33ml
蒸馏水 1000ml
PH7.4
18.2 制法 先将蛋白胨、琼脂、蒸馏水制成PH7.4的普通肉脂，121℃灭菌20分钟。趁热加入乳糖、摇匀。再依次加入其它，充分摇匀，使溶解，倒成平板备用。
18.3 用途 沙门氏菌分离培养用
注：配好的培养基宜当日使用，或保存于冰箱内，3天用完。
19.尿素琼脂
19.1 成分
蛋白胨 1g
氯化钠 5g
葡萄糖 1g
磷酸二氢钾 2g
0.2％酚红溶液 6ml
琼脂 20g
蒸馏水 1000ml
20％尿素溶液 100ml
PH7.2±0.1
19.2 制法 将除尿素和琼脂以外的成分配好，校正PH，加入，加热溶化并分装锥形瓶。121℃高压灭菌20分钟。冷至50～℃，加入经过滤除菌的尿素溶液。尿素的最终浓度为2％，分装于试管内，放成斜面备用。
19.3 用途 沙门氏菌鉴别用。
20.氰化钾培养基
20.1 成分
多价蛋白胨 3g
氯化钠 5g
磷酸二氢钾(KH PO ) 0.225g
2 4
磷酸氢二钠(Ka HPO ) 5.64g
2 4
蒸馏水 1000ml
0.5％氰化钾溶液
PH7.6
20.2 制法 除氰化钾外，以上成分配好后，校正PH，121℃灭菌20分钟。冷却后，每100ml培养基加入0.5％氰化钾溶液1.5ml，分装于12×100mm灭菌试管，每管4ml，立刻用灭菌橡皮塞塞紧，置4℃冰箱内，可保存两个月。同时，以不加氰化钾的培养基作对照培养基，分装试管备用。
20.3 用途 沙门氏菌鉴别用注：1.氰化钾为剧毒药，操作时应特别小心。培养基用后，每管加入几粒硫酸亚铁和0.5ml 20％氢氧化钾去毒，再灭菌洗刷。
2.封口不严。氰化钾分解逸出，致使药物浓度降低，是造成假阳性的主要原因，故应特别注意。
21.氨基酸脱羧酶试验培养基
21.1 成分
蛋白胨 5g
酵母浸膏 3g
葡萄糖 1g
蒸馏水 1000ml
1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1ml
L一氨基酸或DL一氨基酸 0.5或1g／100ml
PH6.8
21.2 制法：除氨基酸外，以上成分加热溶解后，校正PH，分装每瓶100ml。分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L一氨基酸按0.5％加入，DL一氨基酸按1％加入。再行校正PH至6.8。同时以不加氨基酸的培养基作为对照培养基。分装于灭菌的小试管内，每管1ml，并滴加一层液体石蜡，121℃灭菌10分钟。
21.3 用途 沙门氏菌鉴别用
22.十六烷三甲基溴化铵琼脂
22.1 成分
牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
十六烷三甲基溴化铵 0.3g
(Cetyl Trimethylammonium Bromi
de)
琼脂 15～20g
蒸馏水 1000ml
PH7.4～7.6
22.2 制法 除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，校正PH，琼脂。分装锥形瓶，121℃灭菌20分钟。冷至50℃左右倾注平
22.3 用途绿脓杆菌分离培养用
23.绿脓菌素测定用培养基(PDP琼脂)
23.1 成分
蛋白胨 20g
氯化镁(无水) 1.4g
硫酸钾(无水) 10g
琼脂 18～20g
甘油(CP) 10ml
蒸馏水 1000ml
PH7.4
23.2 制法 蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加入蒸馏水中，微温使溶。
校正PH，加入甘油及琼脂，加热溶解，分装至试管。121℃高压灭菌20分钟，置成斜面备用。
23.3 用途 测定绿脓菌素用
24.明胶培养基
24.1 成分
牛肉膏 3g
蛋白胨 5g
明胶 120g
PH7.4
24.2 制法 各成分加入蒸馏水中，浸泡约20分钟，随时搅拌，使溶，校正PH。分装于小试管。115℃高压灭菌20分钟。
24.3 用途 绿脓杆菌鉴别用
25.硝酸盐胨水培养基
25.1 成分
蛋白胨 10g
酵母膏 3g
硝酸钾 2g
亚硝酸钠 0.5g
蒸馏水 1000ml
PH7.4
25.2 制法 蛋白胨及酵母膏加入蒸馏水中，微温使溶。校正，加入硝酸钾和亚硝酸钠溶解混匀。分装于含倒管的小试管内，5℃灭菌20分钟。
25.3 用途 绿脓杆菌鉴别用。
26.亚碲酸钠肉汤培养基
26.1 成分
普通肉汤培养基 100ml
10％亚硝酸钠液 0.2ml
26.2 制法 精确称取亚碲酸钠0.1g，加在10ml蒸馏水中，微温使溶。临用前于每100ml肉汤培养基中加0.2ml，混匀即得。
26.3 用途 金黄色葡萄球菌增菌培养用
注：亚碲酸钠液须临时配制，不可久存。
27.北沙参亚碲酸钠胨水培养基
27.1 成分
蛋白胨 15g
酵母浸膏 5g
氯化钠 5g
磷酸氢二钾 5g
10％北沙参浸液 150ml
蒸馏水 850ml
PH7.4～7.6
27.2 制法 各成分混合，微温使溶，校正PH，加热煮沸，过滤，补足液量。分装每瓶100ml，115℃灭菌30分钟。临用时于每瓶内加入新配制的1％亚碲酸钠液0.2ml。
北沙参浸液的制备：取北沙参100g，用水洗净浸泡在1000ml蒸馏水中，置冰箱过夜泡软。次日将北沙参切成小片，仍置原蒸馏水中继续浸泡2小时。加热煮沸30分钟，用四层纱布过滤浸液，并将药渣用蒸馏水浸洗1～2次合并在浸液中，补足液量至1000ml即得。分装，115℃灭菌30分钟备用。第一次开瓶用过之后，可在浸液内加入1％的氯仿作防腐剂，盖好瓶塞充分振摇，第2天再振摇数次即可在冰箱内长期保存。
27.3 用途 金黄色葡萄球菌增菌培养用
28.卵黄高盐琼脂
28.1 成分
蛋白胨 6g
氯化钠 30g
牛肉膏 1.8g
琼脂(用量3％) 650ml
10％氯化钠卵黄液 100ml
PH7.6
28.2 制法 蛋白胨、牛肉膏及氯化钠加入蒸馏水中，加热溶解，校正PH。加入琼脂，加热使溶，过滤。121℃灭菌20分钟。待冷至60℃时，加入卵黄盐液，混匀后倾注平皿。
10％氯化钠卵黄液制备 取新鲜鸡蛋一个，以碘酒和酒精充分消毒蛋壳后，用无菌镊子在鸡蛋两端各打开一孔，弃去蛋清，以无菌操作取出卵黄，置装有玻璃珠的100ml10％氯化钠灭菌溶液锥形瓶中，充分摇匀即得。
28.3 用途 金黄色葡萄球菌分离培养用
29.甘露醇高盐琼脂
29.1 成分
蛋白胨 10g
牛肉膏 1g
D一甘露醇 10g
氯化钠 75g
琼脂 15～20g
酚红 25mg
蒸馏水 1000ml
PH7.4±0.2
29.2 制法 除酚红、琼脂外，其它成分加入蒸馏水中，微温使溶，校正PH，加入1％酚红水溶液2.5ml，混匀后分装锥形烧瓶，按比例加入琼脂。115℃灭菌30分钟，备用。
29.3 用途 金黄色葡萄球菌分离培养用
30.庖肉培养基
30.1 牛肉碎块的制备 取新鲜牛肉，除去脂肪及筋腱，加水煮沸约10分钟，切成约5mm平方米的小块，称重，按1∶3(肉∶水)加蒸馏水，置4～10℃浸泡18～20小时后，煮沸1小时，用白布过滤(滤液即为1∶3牛肉浸液)，肉渣以自来水漂洗2次，然后加入适量氢氧化钠液，搅拌，使PH在8、4左右，浸泡过夜，次日倾去上层水，用蒸馏水冲洗2～3次，放在纱布上，自动沥干(不要挤压)。将肉渣铺在搪瓷盘上，121℃灭菌20分钟，于80～100℃烘干，筛去碎屑，装瓶，保持干燥，备用。
30.2 庖肉培养基的制备 将上述碎肉块装入中试管内约1cm高，再加入肉汤培养基约10ml，121℃灭菌后备用，最终PH应为7.2～7.6。
30.3 用途 破伤风杆菌增菌培养用
31.0.1％葡萄糖庖肉培养基于庖肉培养基中加入0、1％葡萄糖即得。用于破伤风杆菌增菌产毒培养。
32.血琼脂培养基
32.1 成分
肉汤琼脂 100ml
无菌脱纤维兔血(或羊血) 5～10ml
32.2 制法 将普通肉汤琼脂培养基加热融化，待冷至50℃左右，以无菌操作吸取无菌脱纤维兔血加入摇匀，制成平板。置冰箱内，备用
32.3 用途 破伤风杆菌及金黄色葡萄球菌分离培养用
33.1％葡萄糖血琼脂
33.1 制法 于普通肉汤琼脂中加入1％葡萄糖，115℃高压灭菌30分钟，冷至约50℃时，无菌操作加入5～10％的脱纤维兔血或羊血混匀，倾注平皿，凝后，烘干凝固水备用。
33.2 用途 破伤风杆菌分离培养用
34.庖肉琼脂培养基
34.1 于庖肉培养基中加入0.1～0.3％琼脂，溶化后分装小试管，121℃高压菌20分钟。即得。用于破伤风杆菌保存菌种用
35.新霉素葡萄糖血琼脂
35.1 成分
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
葡萄糖 10g
新霉素 0.1g
(或硫酸新霉素 0.143g)
牛肉浸液(1∶3) 1000ml
35.2 制法 除葡萄糖、新霉素外，混合上述其它成分，加热使溶解后，加入葡萄糖、新霉素，115℃高压灭菌30分钟。冷至45～50℃时，无菌操作加入6～8％的脱纤维兔血(或羊血)，摇匀，倾注平皿，用前烘干表面冷凝水。
35.3 用途 破伤风杆菌分离培养用
36.1 成分
葡萄糖 5g
蛋白胨 15g
氯化钠 2.5g
酵母浸膏 5g
硫乙醇酸钠 1g
蒸馏水 1000ml
36.2 制法 除硫乙醇酸钠外，其它各成分加在蒸馏水中，加热溶解、校正PH，加入硫乙醇酸钠，混匀使溶，过滤，分装每瓶100ml。115℃高压灭菌30分钟即得36.3 用途 供试液“灭活”处理用
第四条 无菌室、净化工作台技术要求及微生物实验室守则
1.无菌室、净化工作台技术要求
(1)无菌室、净化工作台应设在较洁净的环境内。附近无污染源。
(2)室内六面应光滑平整、无缝隙，不起灰不落尘，耐腐蚀、易清洗。墙与地面、墙壁之间相接处应有一定弧度，不留死角。
室内门窗结构应密合，并尽量减少活动窗口面积。
(3)无菌室外应设缓冲间，其结构同无菌室，作进入无菌室之前更衣戴帽等准备工作。
(4)无菌室内按每立方米2～2.5W设置紫外线杀菌灯。应定期检查杀菌效果，对失效者应及时更换。
(5)无菌室关键操作点及净化工作台操作区的净化级别应为100级，即平均菌落数≤1个，≥0.5μm粒子数≤3.5个／L。
(6)室内温度宜控制在20～24℃，湿度45～60％。
2.微生物实验室守则
(1)实验室应经常保持清洁，严禁吸烟和饮食。
(2)工作人员入室时，必须穿戴工作衣帽。离室时脱去工作衣帽，挂于指定地点，并经常洗涤消毒，保持清洁。
(3)工作人员操作前后或离开实验室，必须用肥皂或消毒液洗手。
(4)严防一切灭菌器材和培养基污染，已污染者应停止使用。
(5)发生菌液(或培养液)污染台面或地面时，应即以3％来苏儿或5％石炭酸等消毒液倾覆其上，半小时后再行洗擦，如为破伤风杆菌则应隔液后再行洗擦。
(6)工作衣、帽、口罩等受到菌液污染时，应立即脱去，高压蒸汽灭菌后洗涤。
(7)如有传染性培养物污染手部，应先用酒精棉球拭去，再浸入5％来苏儿等消毒液内片刻，再用肥皂及清水彻底洗刷干净。
(8)接种环(针)每次使用前后，必须通过火焰灭菌。待灭菌冷却后，方可接种培养物。
(9)废弃培养物应放入消毒桶内，121℃高压灭菌后洗刷。带菌的实验用品应浸泡在5％来苏儿溶液内，24小时后取出冲洗。
(10)凡带有活菌的物品，必须经消毒后才能在水笼头下冲洗，严禁污染下水道。
